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目的:
神经炎症在帕金森病(Parkinsons disease，PD)发病机制中占有重要作用，小胶质细胞NLRP3炎症小体激活是PD炎症级联反应的核心事件。本论文拟研究胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)及其下游分子硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)对小胶质细胞NLRP3炎症小体的调控及其在PD炎症中的作用。
方法:
在体研究以8周龄左右的雄性C57BL/6小鼠为研究对象，通过脑立体定位术将细菌脂多糖(LPS，7.5μg/1.5μl/site)注射至双侧黑质构建PD小鼠炎症模型。为了研究CBS过表达对NLRP3炎症小体及PD炎症的影响，将携带cbs基因的腺相关病毒rAAV-Cbs(滴度:1.05E+12)或对照病毒rAAV-Vector(滴度:1.08E+12)经脑立体定位注射至双侧黑质，病毒过表达第14天再次经脑立体定位注射LPS，第7天以免疫组化染色观察小胶质形态与数目变化，免疫印迹法检测腹侧中脑组织NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。荧光定量PCR检测纹状体内pro-IL-1β前体mRNA水平。
离体实验以培养的小鼠原代小胶质细胞和BV2细胞为研究对象，以500ng/mlLPS预处理细胞3h，更换培养基培养过夜，加入ATP孵育30min诱导炎症小体激活为模型。CBS激动剂SAM及H2S供体在ATP之前加入并孵育。以携带cbs基因的慢病毒Lenti-cbs感染BV2细胞诱导CBS过表达;si-RNA技术沉默BV2细胞cbs。免疫印迹法检测细胞上清及裂解液中CBS、NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平;荧光定量PCR检测cbs与pro-IL-1β前体mRNA;ELISA检测细胞上清中IL-1β含量;DCFH-DA探针检测细胞内总活性氧簇(ROS)含量。
结果:
1.黑质定位注射LPS，黑质纹状体内NLRP3炎症小体激活并伴随CBS表达降低。与注射生理盐水组小鼠相比，LPS注射小鼠腹侧中脑及纹状体内NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC、pro-IL-1β)表达增加，而CBS蛋白水平降低。
2.LPS使得原代小胶质细胞pro-IL-1βmRNA水平增加而cbsmRNA水平降低。与未处理组相比(0 h)，LPS处理组原代小胶质细胞cbsmRNA水平降低而pro-IL-1βmRNA增加。
3.CBS过表达抑制LPS诱导的小鼠腹侧中脑小胶质细胞活化及NLRP3炎症小体激活。rAAV-Vec+SALINE组小鼠黑质网状部小胶质细胞呈分支杆状，荧光染色较弱。rAAV-Vec+LPS组黑质网状部小胶质细胞数目增多，Iba-1荧光染色明显增强，局部放大图显示胞体膨大，突起短而粗，呈阿米巴样;而且，与rAAV-Vec+SALINE组相比，rAAV-Vec+LPS组腹侧中脑NLRP3炎症小体相关蛋白指标如NLRP3、ASC蛋白、IL-1β成熟体与caspase-1成熟体均明显升高;纹状体pro-IL-1βmRNA水平增加。相较于rAAV-Vec+LPS组，rAAV-Cbs+LPS组小胶质细胞激活形态明显改善，Iba-1荧光染色明显减少，NLRP3炎症小体相关蛋白表达降低，pro-IL-1βmRNA水平降低，说明过表达CBS抑制了LPS诱导脑内小胶质细胞活化、促炎因子转录及NLRP3炎症小体激活。
4.CBS激动剂与过表达CBS均抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体激活。与对照组相比，加入ATP使得LPS预处理的小胶质细胞上清中IL-1β和caspase-1成熟体水平明显增加;在ATP加入前给予CBS激动剂SAM预孵育减少了上清中IL-1β和caspase-1成熟体含量，表明CBS激动剂能抑制NLRP3炎症小体活化。以慢病毒诱导的CBS过表达产生类似作用。
5.H2S供体抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体激活。与对照组相比，加入ATP使得LPS预处理的小胶质细胞上清中IL-1β和caspase-1成熟体表达明显增加;在ATP加入前给予H2S缓释供体GYY4137或速释供体NaHS均减少培养上清中IL-1β和caspase-1成熟体含量，表明CBS下游产物H2S也能抑制NLRP3炎症小体激活。
6.敲减cbs激活BV2细胞NLRP3炎症小体。siRNA成功敲减BV2细胞内cbs基因后，细胞内NLRP3蛋白明显升高，IL-1β与caspase-1蛋白成熟体表达量增加(与si-con组相比)。
7.CBS激动剂减少小胶质细胞ROS生成。在LPS预处理的BV2细胞内，加入ATP使得胞内总ROS含量急剧增加;在ATP之前给予CBS激动剂SAM预孵育明显抑制胞内ROS产生。
结论:
CBS是小胶质细胞NLRP3炎症小体的重要抑制分子，其机制与抑制胞内ROS产生有关。LPS等病理刺激使得小胶质细胞CBS表达下调，其对NLRP3炎症小体的抑制作用减弱，IL-1β释放增加，加剧了炎症级联反应。CBS激动剂及病毒为载体介导的CBS过表达可以抑制NLRP3炎症小体与PD神经炎症反应。
神经炎症在帕金森病(Parkinsons disease，PD)发病机制中占有重要作用，小胶质细胞NLRP3炎症小体激活是PD炎症级联反应的核心事件。本论文拟研究胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)及其下游分子硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)对小胶质细胞NLRP3炎症小体的调控及其在PD炎症中的作用。
方法:
在体研究以8周龄左右的雄性C57BL/6小鼠为研究对象，通过脑立体定位术将细菌脂多糖(LPS，7.5μg/1.5μl/site)注射至双侧黑质构建PD小鼠炎症模型。为了研究CBS过表达对NLRP3炎症小体及PD炎症的影响，将携带cbs基因的腺相关病毒rAAV-Cbs(滴度:1.05E+12)或对照病毒rAAV-Vector(滴度:1.08E+12)经脑立体定位注射至双侧黑质，病毒过表达第14天再次经脑立体定位注射LPS，第7天以免疫组化染色观察小胶质形态与数目变化，免疫印迹法检测腹侧中脑组织NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。荧光定量PCR检测纹状体内pro-IL-1β前体mRNA水平。
离体实验以培养的小鼠原代小胶质细胞和BV2细胞为研究对象，以500ng/mlLPS预处理细胞3h，更换培养基培养过夜，加入ATP孵育30min诱导炎症小体激活为模型。CBS激动剂SAM及H2S供体在ATP之前加入并孵育。以携带cbs基因的慢病毒Lenti-cbs感染BV2细胞诱导CBS过表达;si-RNA技术沉默BV2细胞cbs。免疫印迹法检测细胞上清及裂解液中CBS、NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平;荧光定量PCR检测cbs与pro-IL-1β前体mRNA;ELISA检测细胞上清中IL-1β含量;DCFH-DA探针检测细胞内总活性氧簇(ROS)含量。
结果:
1.黑质定位注射LPS，黑质纹状体内NLRP3炎症小体激活并伴随CBS表达降低。与注射生理盐水组小鼠相比，LPS注射小鼠腹侧中脑及纹状体内NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC、pro-IL-1β)表达增加，而CBS蛋白水平降低。
2.LPS使得原代小胶质细胞pro-IL-1βmRNA水平增加而cbsmRNA水平降低。与未处理组相比(0 h)，LPS处理组原代小胶质细胞cbsmRNA水平降低而pro-IL-1βmRNA增加。
3.CBS过表达抑制LPS诱导的小鼠腹侧中脑小胶质细胞活化及NLRP3炎症小体激活。rAAV-Vec+SALINE组小鼠黑质网状部小胶质细胞呈分支杆状，荧光染色较弱。rAAV-Vec+LPS组黑质网状部小胶质细胞数目增多，Iba-1荧光染色明显增强，局部放大图显示胞体膨大，突起短而粗，呈阿米巴样;而且，与rAAV-Vec+SALINE组相比，rAAV-Vec+LPS组腹侧中脑NLRP3炎症小体相关蛋白指标如NLRP3、ASC蛋白、IL-1β成熟体与caspase-1成熟体均明显升高;纹状体pro-IL-1βmRNA水平增加。相较于rAAV-Vec+LPS组，rAAV-Cbs+LPS组小胶质细胞激活形态明显改善，Iba-1荧光染色明显减少，NLRP3炎症小体相关蛋白表达降低，pro-IL-1βmRNA水平降低，说明过表达CBS抑制了LPS诱导脑内小胶质细胞活化、促炎因子转录及NLRP3炎症小体激活。
4.CBS激动剂与过表达CBS均抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体激活。与对照组相比，加入ATP使得LPS预处理的小胶质细胞上清中IL-1β和caspase-1成熟体水平明显增加;在ATP加入前给予CBS激动剂SAM预孵育减少了上清中IL-1β和caspase-1成熟体含量，表明CBS激动剂能抑制NLRP3炎症小体活化。以慢病毒诱导的CBS过表达产生类似作用。
5.H2S供体抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体激活。与对照组相比，加入ATP使得LPS预处理的小胶质细胞上清中IL-1β和caspase-1成熟体表达明显增加;在ATP加入前给予H2S缓释供体GYY4137或速释供体NaHS均减少培养上清中IL-1β和caspase-1成熟体含量，表明CBS下游产物H2S也能抑制NLRP3炎症小体激活。
6.敲减cbs激活BV2细胞NLRP3炎症小体。siRNA成功敲减BV2细胞内cbs基因后，细胞内NLRP3蛋白明显升高，IL-1β与caspase-1蛋白成熟体表达量增加(与si-con组相比)。
7.CBS激动剂减少小胶质细胞ROS生成。在LPS预处理的BV2细胞内，加入ATP使得胞内总ROS含量急剧增加;在ATP之前给予CBS激动剂SAM预孵育明显抑制胞内ROS产生。
结论:
CBS是小胶质细胞NLRP3炎症小体的重要抑制分子，其机制与抑制胞内ROS产生有关。LPS等病理刺激使得小胶质细胞CBS表达下调，其对NLRP3炎症小体的抑制作用减弱，IL-1β释放增加，加剧了炎症级联反应。CBS激动剂及病毒为载体介导的CBS过表达可以抑制NLRP3炎症小体与PD神经炎症反应。