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第一部分内皮素-1对大鼠血管平滑肌细胞表型转化和增殖的影响及机制研究目的:通过ET-1作用于大鼠VSMC及对ET-1受体信号的阻断,探讨ET-1对VSMC表型转化和增殖的影响及机制。方法:体外培养大鼠主动脉VSMC,实验取第4～5代细胞。实验一,实验分为:A1:对照组、B1:ET-1组、C1:ET-1+BQ123组。用无血清DMEM培养液同步化处理24h后,各组细胞加入相应药物(ET-1 ,10-7mol/L; BQ123,10-6mol/L),作用48h后收集细胞,用5-BrDU标记细胞增殖情况;RT-PCR检测VSMC增殖负性调控基因HRG-1和表型标志基因SM22α的表达。实验二,实验分为:A2:有血清培养72h组;B2:无血清对照组;C2:ET-1组;D2:ET-1+BQ123组。用无血清DMEM培养液同步化处理24h后,各组细胞换用含10%NCS的DMEM继续培养72h,此时A2组终止培养收集细胞,其余各组换成无血清培养液并分别加入相应药物(ET-1,10-7mol/L;BQ123,10-6mol/L)作用48h,收集细胞,RT-PCR检测HRG-1和SM22αmRNA的表达。结果:实验一:免疫细胞化学检测,ET-1作用组可见大量增殖的VSMC,而加入ET-1受体阻断剂BQ123后标记的增殖细胞显著减少。RT-PCR检测中,ET-1组HRG-1和SM22αmRNA表达较对照组有明显下调,而加入阻断剂BQ123可拮抗这一作用。实验二: RT-PCR检测进一步证实BQ123有阻断ET-1下调VSMC HRG-1和SM22α两个基因表达的作用。结论:1.ET-1对收缩型VSMC有明显的促增殖作用,并可使VSMC表型从收缩型向合成型转化;2.ET-1对合成型VSMC同样有促表型转化和增殖的作用,表明ET-1对VSMC的作用是一种不可逆的因素。3.受体信号途径是ET-1促VSMC表型转化和增殖的作用机制之一。第二部分内皮素-1与CGRP共作用对血管平滑肌细胞表型转化和增殖的影响目的:通过ET-1与降钙素基因相关肽(CGRP)共同作用于VSMC,研究CGRP抑制ET-1促VSMC表型转化和增殖的作用及机制。方法:体外培养大鼠主动脉VSMC,实验取第4～5代细胞。实验一,实验分为: a1:对照组;b1:ET-1组;c1:ET-1+CGRP组(ET-1作用24h后,再加CGRP);d1:CGRP+ET-1组(CGRP作用24h后,再加ET-1)。无血清DMEM培养液同步化处理24h后,各组细胞加入相应药物(ET-1 10-7mol/L;CGRP,2×10-7mol/L),作用48h后收集细胞,用5-BrDU标记细胞增殖情况,RT-PCR检测HRG-1和SM22αmRNA的表达。实验二,试验分为:a2:血清培养72h组;b2:无血清对照组;c2: ET-1组; d2:ET-1+CGRP组(ET-1作用24h后,再加CGRP);e2:CGRP+ET-1组(CGRP作用24h后,再加ET-1)。无血清DMEM培养液同步化处理24h后,各组细胞换用含10%NCS的DMEM继续培养72h,此时a2组终止培养收集细胞,其余各组换成无血清培养液并分别加入相应药物(ET-1 10-7mol/L;CGRP,2×10-7mol/L)作用48h,收集细胞,RT-PCR检测HRG-1和SM22αmRNA的表达。结果:实验一:免疫细胞化学检测,ET-1组有大量标记的平滑肌增殖细胞,加入CGRP后增殖细胞稍微有所减少,而先加CGRP作用组中增殖细胞数量大大减少。RT-PCR检测中,ET-1组较对照组VSMC HRG-1和SM22α基因表达显著下调;加入CGRP两基因表达有所上调,但不明显;而现加CGRP作用组中两种基因表达上调明显。实验二: RT-PCR检测进一步证明,CGRP可阻断ET-1下调VSMC HRG-1和SM22αmRNA的表达,但先加入CGRP效果更显著。结论:1.CGRP对ET-1促VSMC增殖有抑制作用,其作为预防性给药效果更明显。2.CGRP对ET促VSMC表型转化(从收缩型向合成型)有逆转作用,并同样作为预防性给药效果更显著。