研究目的在实验室中自行制备转化生长因子-β1(TGF-β1)/壳聚糖缓释微球、纳米羟基磷灰石/胶原支架材料及负载转化生长因子-β1(TGF-β1)/壳聚糖缓释微球的纳米羟基磷灰石/胶原支架材料。然后分别以单纯支架材料及负载转化生长因子-β1(TGF-β1)/壳聚糖缓释微球的支架材料应用于兔桡骨骨缺损的修复。通过观察术后各个固定时间段骨缺损区成骨修复情况,来证实纳米羟基磷灰石/胶原骨修复兔桡骨骨缺损的能力及转化生长因子-β1在骨组织修复过程中的效应。为应用骨组织工程方式临床修复大块骨缺损探寻一种有效的方法。研究方法1.应用乳化交联法制备负载TGF-β1的壳聚糖缓释微球,并对TGF-β1壳聚糖缓释微球的外观形态、载药量、包封效率及体外释放情况进行分析。2.制备纳米羟基磷灰石/胶原骨及纳米人工骨/TGF-β1壳聚糖缓释微球复合人工骨,并对两种人工骨进行扫描电镜观察、孔隙率、力学性能进行测定。3.选择普通新西兰大白兔45只,双侧桡骨手术建立10mm骨缺损模型,同时将单纯纳米羟基磷灰石/胶原骨支架材料植入左侧桡骨骨缺损中,设定为对照组;将负载转化生长因子-β1(TGF-β1)/壳聚糖缓释微球的纳米羟基磷灰石/胶原支架材料植入右侧桡骨骨缺损中,设定为实验组。在手术后的第2周、第4周、第6周、第8周、第12周时间段,每次随机从45只实验动物中选取9只处死,对其双前肢行X射线拍照、缺损手术区行骨密度测定及病理切片组织学分析,对各个不同时期骨缺损修复情况进行评估。对实验组及对照组的不同评估数据进行统计学分析、对比,从而证实两种不同支架材料修复骨缺损的效果是否存在差异。结果制备的TGF-β1/壳聚糖缓释微球的性状:微球呈淡黄色粉末状。扫描电镜观察到所制备的TGF-β1壳聚糖微球基本呈类球形,大小均匀,直径约为5μm,表面光滑,有较多微小孔隙,分散度较好。TGF-β1/壳聚糖缓释微球的载药量和包封率测定结果:共放入TGF-β1的量为5μg,TGF-β1壳聚糖微球10mg溶解后制备得到的上清液样本以人TGF-β1 ELISA试剂盒进行检测,TGF-β1壳聚糖微球的载药量为22.9μg/g,包封率为79.5%。TGF-β1壳聚糖微球体外释放情况:在前12小时内TGF-β1因子释放速度较快,以后逐渐平缓,到第6天,TGF-β1壳聚糖微球释放量为55.5%。大体观察:在手术后2周时,在实验侧手术部位支架材料的轮廓是清晰的,触之感觉其硬度增加,其与兔桡骨的两端连接部位连接牢固。而对照组支架材料轮廓也清晰,局部触之无明显变硬,连接部位连接无实验侧牢固,但未出现移位情况;手术后第4周,切口处支架材料的轮廓已不明显,实验侧手术部位已看不到轮廓。人工骨与宿主骨断端间结合更加紧密,移植材料体表触感质地更加坚硬。对照侧纳米骨与宿主骨间连接紧密程度及坚硬程度较实验组差;术后第6周,实验侧人工骨与宿主骨断端间可扪及隆起骨痂,质地变硬。对照侧支架材料与桡骨交界处也可以触及新形成的骨痂,但是其大小及硬度均不如实验侧;手术后第8周,实验侧支架材料外部也变硬,形成包壳样结构,支架材料与桡骨交界处形成的骨痂触之更加坚硬,连接部位结合已十分牢固,对照侧也可扪及硬的包壳及骨痂,但其硬度不如实验侧,其连接部位结合也比较牢固;手术后第12周,实验侧的支架材料处外部触之已十分坚硬,交界处的骨痂已基本触不到,手术区骨质与宿主骨触之已十分相似,对照侧较实验侧为差。X射线观察:观察内容包括骨形成、骨连接及骨塑形3个方面11项内容。实验侧在术后2周即有成骨表现,但成骨部分占骨缺损部分比例不到25%,交界处可见少许骨痂形成,分界线模糊,未见骨塑形情况;对照侧未见明显成骨表现,交界处分界线清晰,无骨塑形情况。4周时实验侧有部分骨痂形成,成骨部分占骨缺损部分比例达到25%,但不足50%,交界处可见部分骨痂形成,分界线更为模糊,但未消失,未见明显骨塑形情况;对照侧可见成骨表现,但成骨部分占骨缺损部分比例不到25%,交界处分界线模糊,无骨塑形情况。6周时实验侧有大量骨痂形成,成骨部分占骨缺损部分比例达50%,但未超过75%,植入骨与宿主骨接触间隙极为模糊至基本消失,未见正常髓腔形成及皮质骨塑形;对照侧成骨部分占骨缺损部分比例达到25%,但不足50%,交界处可见有少许骨痂形成,分界线已经模糊,未见正常髓腔形成及皮质骨塑形。8周时实验侧骨痂进一步增加,成骨占骨缺损部分比例达75%以上,但骨缺损未完全愈合,植入骨与宿主骨接触间隙基本消失,可见到髓腔样结构形成但无皮质骨塑形表现;对照侧也有大量骨痂形成,成骨部分占骨缺损部分比例达50%,但未超过75%,植入骨与宿主骨接触间隙极为模糊,未见正常髓腔形成及皮质骨塑形。12周时实验侧骨缺损全部愈合,新生骨完全填充骨缺损部位,移植骨-宿主骨间隙完全消失,髓腔再通,皮质骨已经塑形成为成熟的板层骨;对照侧骨痂进一步增加,新生骨占骨缺损部分比例达75%以上,但骨缺损未完全愈合,植入骨与宿主骨接触间隙基本消失,可见到髓腔样结构形成但无皮质骨塑形表现。骨密度测定:骨密度,全称“骨骼矿物质密度”。骨密度是骨质量的一个重要标志。手术后第2周对实验侧骨缺损区行骨密度测定,发现骨缺损区支架材料骨密度值比体外制备的纳米支架材料骨密度值增高;并在随后的第4周、第6周、第8周及第12周行骨密度测定,其数值均高于体外纳米支架材料的骨密度数值,并且其骨密度值随时间的增长而增高,尤其在术后第12周,骨缺损区的骨密度测定数据与实验动物桡骨本身骨密度数值达到同一水平。而在实验动物的对照侧,骨缺损区的骨密度数值高于体外纳米支架材料密度出现在术后第4周。在随后的几个时间段其骨缺损区骨密度数值也随时间而增高,但是即便在第12周时,缺损区骨密度数值也低于实验动物桡骨本身的骨密度数值。组织学观察:实验侧在术后2周即表现活跃成骨,成骨类细胞增加,局部开始出现细胞外基质沉积,对照组的成骨活跃程度较实验组要差;复合支架材料的实验组在手术后第2周病理切片局部可以观察到在材料周边有骨痂形成,随时间推移,在以后的第4周、第6周、第8周时间段,骨痂的数量逐渐增多,组织学结构“骨单位”开始形成并出现,骨单位逐渐增多并成熟。纳米支架材料在体内逐渐被降解、吸收,破骨细胞对新生骨进行改建,髓腔结构逐渐形成,在手术后的第12周,骨单位均已十分成熟,大量板层骨在骨缺损区形成,板层骨已经取代了排列杂乱的新生骨,髓腔再通,局部骨缺损得以修复,新骨与宿主骨已完全结合,塑形完成。单纯支架材料的对照侧在材料周边病理切片观察到新生骨出现在手术后第4周,其进程与实验侧成骨进程相似,但在同一时间段,对照侧的成骨数量及新生骨的成熟度均较实验侧差,在术后第12周时,虽然出现的骨单位结构也逐渐成熟,并且逐渐增多的大量骨痂填充骨缺损区,但新骨的改建及塑形还没有完成,髓腔结构刚刚开始形成,没有形成大量成熟的板层骨。结论1.采用乳化交联方法制备复合转化生长因子β1的壳聚糖缓释微球的方法简便易行,成球性好,获取率高,具有优良的缓释效果。2.TGF-β1对创伤、肿瘤、先天畸形等原因导致的骨缺损的修复、骨组织的生长等方面发挥着积极的效应。其发挥效应的机制是TGF-β1对成骨细胞的增殖、分化、微血管形成及细胞外基质的形成有一定的促进作用。在骨组织工程的应用中有着重要的意义。3.复合转化生长因子-β1(TGF-β1)/壳聚糖缓释微球的纳米晶胶原基骨(n HAC)是一种良好的修复骨缺损的骨组织工程材料。4.单纯纳米支架材料本身也是优良的骨缺损修复材料,它可以直接植入骨缺损区作为支架材料,桥接骨缺损区的周边骨质,诱导新骨形成并修复骨缺损;同时,它也可以作为骨组织工程的载体,将种子细胞或细胞因子与其复合,从而更加有效的修复和治疗骨缺损。