主动脉瓣疾病(aortic valve disease,AVD)是最常见的心脏瓣膜疾病。随着人口老龄化加剧,全球范围内以纤维增生钙化和粘液样改变为代表的退行性主动脉瓣病变比例逐年升高。与此同时,在我国风湿性瓣膜病仍在主动脉瓣疾病中占有很大比例。对于AVD患者尚无有效的药物治疗方案,主动脉瓣置换手术是唯一有效的治疗方式,成本高,风险大,社会负担重。主动脉瓣病变涉及多种细胞和生物学过程,既往研究虽然对其特定表型和机制进行了一定程度的探索,但未能系统阐明病变的关键环节和干预靶点。因此,系统描述主动脉瓣病变表型,在传统分子生物学实验研究的基础上,应用组学技术和AVD患者瓣膜样本,全面描述参与病变的分子、细胞种类与功能,结合生物信息学分析构建相互作用网络,对于明确发病机制中的关键分子、细胞类型具有十分重要的意义,也会为疾病的有效精准干预提供新的靶点。主动脉瓣解剖结构包括正常三叶主动脉瓣,二叶化主动脉瓣及其亚型等多种分型,通过影响主动脉瓣血流动力状态参与疾病发生。然而,既往研究并未对主动脉瓣解剖结构进行精确的区分,不同解剖结构对应AVD表型特征并不明确。因此,本研究第一部分根据精准主动脉瓣解剖结构分型,从临床特征、主动脉瓣组织病理改变、血流动力学状态对不同分型AVD患者,包括不同二叶化主动脉瓣亚型患者的表型进行描述和比较,为系统开展主动脉瓣病变表型和发病机制研究奠定了基础。第一部分研究明确了纤维钙化改变是主动脉瓣病变的主要表型之一。瓣膜间质细胞激活与成骨转化是主动脉瓣钙化的关键环节。瓣膜发育相关的生物学过程被认为同样参与疾病的发生。Meis2在主动脉瓣发育阶段在瓣膜区域特异性高表达,并且参与瓣膜病相关信号通路的调控,但其在钙化性主动脉瓣疾病中的作用与机制并不明确。因此,本研究第二部分针对Meis2在主动脉瓣钙化病变以及瓣膜间质细胞成骨转化过程中的作用与机制进行了研究。退行性主动脉瓣病变包括主动脉瓣纤维钙化和主动脉瓣粘液样变,两者存在一定的区别与联系。根据第一部分研究结果,退行性主动脉瓣病变已成为最主要的主动脉瓣病变表型。退行性变发生与环境因素刺激有关,长链非编码RNA(lncRNA)在这一过程中可以发挥作用。主动脉瓣机制研究也发现一些lncRNA参与调控疾病的关键环节。然而,lncRNA在退行性主动脉瓣病变中的整体差异表达以及不同病理表型之间的差异尚不明确。因此,本研究第三部分应用转录组学技术对退行性主动脉瓣疾病差异表达lncRNA进行了研究,并使用生物信息学方法对其可能的作用与机制进行了分析。为转录组水平全面阐明退行性病变相关lncRNA以及后续更为深入的发病机制研究提供了新的依据。根据第一部分研究,主动脉瓣退行性变和风湿样变涵盖了几乎全部AVD患者的疾病表型。第二、三部分研究结果则提示细胞激活、转化等过程均与疾病相关,这些过程涉及多种细胞类型的生物学功能。但是,正常和疾病状态下主动脉瓣细胞类型及构成变化,以及病变关键细胞类型尚不清楚。因此,本研究第四部分应用单细胞测序技术,进一步全面的对主动脉瓣病变细胞微环境进行了描述,并使用生物信息学方法对关键细胞类型及其功能进行了分析。主动脉瓣病变表型和发病机制研究的具体4部分研究内容摘要如下:第一部分:基于主动脉瓣外科手术精准解剖分型的主动脉瓣疾病表型分析研究背景:主动脉瓣解剖结构在主动脉瓣疾病(aortic valve disease,AVD)的进展以及治疗策略的制定过程中具有重要作用。本研究根据主动脉瓣外科手术过程中获得的精准主动脉瓣解剖结构分型,描述和比较了不同解剖分型AVD患者的疾病表型。方法:本研究入选了初次接受外科主动脉瓣置换术的患者。以手术过程中获得的主动脉瓣解剖结构作为分型依据。采集了患者的人口学特征、主动脉瓣组织病理诊断结果、术前经胸心脏彩超(transthoracic echocardiography,TTE)诊断和其他可获得的术前影像学检查结果等资料。从临床特征、组织病理改变和血流动力学状态等方面描述和比较了不同主动脉瓣解剖分型AVD患者的疾病表型。同时,以术中解剖分型诊断为准,对于AVD患者术前影像学诊断解剖分型的准确性进行了分析。结果:研究共纳入2017年6月至2018年3月期间初次接受外科主动脉瓣置换术的602例患者(平均年龄55.5±12.9岁;男性比例74.1%)。根据术中解剖分型诊断,370例患者为三叶主动脉瓣(tricuspid aortic valves,TAV),228例患者为二叶化主动脉瓣(bicuspid aortic valves,BAV),以及4例四叶化主动脉瓣(quadricuspid aortic valves,QAV)。主动脉瓣组织病理改变方面,TAV患者主要表现为粘液样退行性变,占比48.4%;BAV患者主要表现为纤维钙化,占比57.9%。主动脉瓣血流动力学改变方面,几乎全部TAV患者发生了不同程度的主动脉瓣反流,比例为96.2%;大部分BAV患者主要表现为不同程度的主动脉瓣狭窄,比例为73.7%;不同BAV亚型患者之间,主动脉瓣狭窄和反流的严重程度存在差异。对于全部入选患者,术前TTE诊断主动脉瓣解剖结构的准确性为85.5%;对于TAV和BAV患者,术前TTE诊断主动脉瓣解剖结构准确性存在显著差异(TAV96.8%,BAV68.0%,P<0.001)。结论:本研究根据主动脉瓣精准解剖分型对AVD患者疾病表型进行了描述和比较。TAV患者与BAV患者、QAV患者之间,以及不同BAV亚型患者之间,AVD表型在组织病理改变和血流动力学方面存在显著差异。此外,术前TTE检出BAV的准确性偏低,制定AVD治疗方案过程中需要更为精准的评价主动脉瓣解剖结构。第二部分:Meis2在主动脉瓣间质细胞钙化过程中的作用与机制研究背景:钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)是最常见的瓣膜疾病类型。主动脉瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)的成骨转化是CAVD的关键环节,但是其具体机制尚未完全阐明。主动脉瓣VICs在发育阶段来源于内皮间质细胞转化过程或者心脏神经嵴细胞的迁移。Meis2在心脏发育阶段参与上述两个过程,但其是否在CAVD中发挥作用尚不明确。本部分将对Meis2在CAVD过程中VICs成骨转化的作用与机制进行研究。方法:分别利用人类钙化(30例)和正常(30例)主动脉瓣组织检测Meis2的表达水平。利用猪主动脉瓣VICs构建Meis2抑制细胞模型,并检测其对于VICs成骨转化过程的影响及下游信号通路。结果:与正常主动脉瓣组织相比,人类钙化主动脉瓣中Meis2在mRNA和蛋白质水平均明显降低。体外实验中,利用siRNA抑制Meis2的表达会降低猪主动脉瓣VICs中Notch1和Twist1的表达水平,同时导致VICs成骨转化增强。结论:Meis2可能通过维持Notch1/Twist1信号通路水平抑制主动脉瓣VICs成骨转化过程,有可能成为干预CAVD的新靶点。第三部分:人类退行性主动脉瓣组织长链非编码RNA表达谱分析研究背景:长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在心血管疾病过程中具有重要的功能。但是退行性主动脉瓣疾病中lncRNA的表达情况及具体功能尚不明确。方法:采集人类退行性病变主动脉瓣组织,与正常主动脉瓣对照,分析lncRNA差异表达情况。利用生物信息学方法,对差异lncRNA的功能和作用机制进行分析和预测。结果:本研究共纳入32例人类主动脉瓣组织,其中正常组12例,纤维钙化组和粘液样变组各10例。与正常组相比,纤维钙化组发现差异lncRNA 93个,其中上调46个,下调47个;粘液样变组发现差异lncRNA 87个,其中上调52个,下调35个。差异lncRNA共表达mRNA功能富集分析提示与细胞增殖、迁移以及成骨反应等病理生理过程相关。构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络对lncRNA作用机制进行预测,得到5个关键节点lncRNA。结论:本研究在人类纤维钙化和粘液样变主动脉瓣组织中发现了一系列差异表达的lncRNA,并对差异lncRNA的功能和作用机制进行了预测。第四部分:基于单细胞测序技术的主动脉瓣疾病细胞微环境研究背景:主动脉瓣疾病的发生涉及多种细胞的共同参与,但其中的关键细胞类型和病理生理过程尚不明确。本研究拟通过单细胞测序技术对人类主动脉瓣疾病细胞微环境进行描述,并对关键细胞类型及其功能进行分析。方法:采集心脏外科手术患者主动脉瓣组织,消化分离获得细胞。应用单细胞测序技术对细胞转录组进行测序。结合生物信息学分析方法对细胞类型和功能进行描述和分析。结果:本研究共对4314个人类主动脉瓣组织细胞进行了单细胞测序,并对其中4116个细胞数据进行了分析。共获得13种细胞,包括内皮细胞1种,间质细胞7种,免疫细胞4种和心肌细胞1种。内皮细胞在正常主动脉瓣数量和比例最高。间质细胞的增殖和分化是主动脉瓣疾病的主要过程,VIC-FOSB+和VIC-BMP2+是主动脉瓣纤维增生钙化的关键细胞类型。非典型巨噬细胞促进主动脉瓣疾病过程的发生。结论:本研究应用单细胞测序技术对人类主动脉瓣疾病细胞微环境进行了描述。发现VIC-FOSB+和VIC-BMP2+是主动脉瓣纤维钙化过程中的关键细胞类型。为后续主动脉瓣疾病全面深入的机制研究提供了靶点和依据。