背景与目的随着我国逐步步入老龄社会,缺血性脑血管病逐渐成为危害人类健康的多发病、常见病。高致病率、高复发率以及高致残率为脑血管病的特点,给社会、家庭和个人带来了沉重的经济和精神负担。因此,探索积极有效的干预治疗措施已成为目前研究的重点。脑动脉闭塞造成脑缺血,使局部脑组织血流下降或中止,导致细胞功能障碍或形态的破坏,立即恢复血流是关键。但是,伴随恢复血流发生的再灌注损伤也不可忽视。所谓的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)是指缺血的组织器官在一定的时间后,虽然恢复血供,组织损伤,器官功能障碍没有减轻,临床症状甚至有进一步加重的现象。目前研究认为：缺血再灌注损伤病理生理过程中至关重要的是血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的完整性。血脑屏障(BBB)是存在于脑组织和血液之间的一个复杂的细胞系统,由中枢神经系统血管内皮细胞、内皮细胞的紧密连接、基底膜以及毛细血管基底膜外的星形胶质细胞终足构成,其能控制血、脑两侧的物质转运,保证中枢神经组织内环境的相对稳定。其中血管基底膜主要由细胞外基质分子(ECM)组成,主要成分包括Ⅳ型明胶原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白,对维持血脑屏障(BBB)的完整性至关重要。近年来研究认为基质金属蛋白酶(MMPs),尤其是MMP-9在血脑屏障的开放机制方面具有更重要的意义。给予外源抑制剂抑制MMP-9活性,可减少大鼠脑缺血后的脑梗死体积；脑损伤中,MMP-9的表达过度活跃,可以通过降解神经血管基质,进而损伤血脑屏障(BBB)引起脑水肿和出血。MMP-9底物主要为细胞外基质中Ⅳ型胶原,又称为Ⅳ型胶原酶。因此,寻找以基质会属蛋白酶中MMP-9及其底物血管基底膜Ⅳ型胶原(collagenⅣ)为作用靶点,进而减轻血脑屏障的通透性,减轻脑损伤,发挥神经保护剂作用意义重大。丁苯酞是从芹菜种籽中分离出的有效成分。可分为左旋丁基苯酞(1-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)及消旋丁基苯酞(dl-NBP),经合成的消旋化合物为黄色油状液体,具芹菜香味。已应用于缺血性脑血管病的治疗,本品可改善卒中发生后的神经功能缺损症状,促进患者功能恢复。但其在治疗局灶性脑缺血再灌注损伤中的分子机制尚未完全阐明。既往研究对脑缺血再灌注损伤的机制多侧重于其对清除氧自由基、抗凋亡和抗炎症反应的作用。但是对局灶脑缺血再灌注损伤中MMP-9活性、基底膜Ⅳ胶原及血脑屏障通透性的影响还不清楚。本研究通过参照并改进ZeaLonga线栓法,制备SD大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,观察缺血侧大鼠脑组织MMP-9活性、基底膜成分Ⅳ型胶原表达、BBB通透性的变化,以及丁苯酞治疗后的效果。进一步探索丁苯酞对脑缺血再灌注损伤神经保护作用机制。材料与方法健康成年雄性SD大鼠90只,体重240-280g,参照ZeaLonga线栓法,并加以改进制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。将实验大鼠随机分为3组,假手术组30只(sham),缺血再灌注损伤组30只(MCAO/R),丁苯酞治疗组30只(NBP)每组按再灌注时间不同各设3个亚组：6h、12h、24h,每个亚组10只大鼠。其中5只用于免疫组织化学测定,另外5只大鼠进行血脑屏障通透性的研究。丁苯酞胶囊以0.5%Tween80制成10mg/ml混悬液,治疗组以再灌注后5min用于动物腹腔注射丁苯酞80mg／kg。假手术组不给药,模型组给予相应体积的生理盐水(1ml/kg)。在预订时间点处死前30min经舌下静脉注射伊文思蓝(2%EB,2ml/kg)。30min后相应时间点处死大鼠,用免疫组织化学方法测定损伤脑组织中MMP-9蛋白及collagen IV胶原,通过测定损伤脑组织中EB含量来观察BBB通透性的变化。分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,多组数据比较采用单因素方差分析,任意两组之间的比较采用LSD检验。P<0.05有统计学差异。结果1MMP-9活性表达：假手术组脑内MMP-9的阳性细胞数在各时间点均比较低；缺血再灌注组MMP-9的阳性细胞数6h可见少量表达,12h持续增加,24h更为显著,各时间点与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)；丁苯酞治疗组缺血脑组织内MMP-9的活性表达在6h、12h、24h升高幅度较模型组各个相同点降低,结果均有统计学意义(P<0.05)。2血脑屏障基底膜Ⅳ型胶原表达：假手术组脑内基底膜collagenⅣ胶原的阳性细胞数在各时间点均比较高；缺血再灌注组基底膜collagenⅣ胶原的阳性细胞数6h表达减少,12h持续降低,24h更为显著,各时间点与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)；丁苯酞治疗组缺血脑组织内的基底膜collagenⅣ胶原活性表达在6h、12h、24h升高幅度较模型组各个相同时间点高,结果均有统计学意义(P<0.05)。3EB含量：大鼠注射伊文思蓝后,全身迅速变蓝。结果显示缺血再灌注组损伤侧脑组织EB含量在6h开始升高,12h持续增加,24h达到高峰。丁苯酞治疗组6h、12h、24h组能明显降低EB含量,减少血脑屏障的破坏,结果均有统计学意义(P<0.05)。结论1、大鼠脑缺血再灌注后随再灌注时间的延长,MMP-9活性表达明显升高,基底膜Ⅳ胶原降低,EB含量增加。说明MMP-9、基底膜collagenⅣ胶原及BBB通透性的改变均参与脑缺血再灌注损伤。2、丁苯酞可以通过降低MMP-9活性表达、减少基底膜collagenⅣ原的降解,进而减轻血脑屏障(BBB)通透性,这可能是丁苯酞在脑缺血再灌注损伤发挥脑保护作用机制之一。