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目的:肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居于第二位。手术治疗被认为是治疗肝癌的潜在治愈性方法。然而,许多无法手术的患者或由残余的HCC细胞增殖复发而预后不良。随着肿瘤发病机制研究的进展,靶向治疗已成为一种新的癌症治疗方法。但是HCC的潜在机制仍然未知。自噬是一种高度保守的过程,通过自我降解来适应微环境胁迫。在缺氧或营养缺乏的情况下,自噬通过降解衰老的细胞器或蛋白质来维持癌细胞的线粒体功能和能量平衡。已有许多研究表明自噬在癌细胞的进展中起着至关重要的作用。因此,探讨HCC中自噬的调节机制对于新兴治疗是十分必要的。长非编码RNA(Lnc RNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA。最近的研究报道了各种Lnc RNA与癌细胞中细胞功能的调节有关。但Lnc RNAs在HCC中的作用仍不清楚。结肠癌相关转录物1(CCAT1)是一种核酸限制性长链非编码RNA。大量研究表明,CCAT1可以调节多种消化系统肿瘤。有趣的是,CCAT1在HCC组织中的表达水平高于邻近的正常组织。然而,从未证实CCAT1参与自噬的调节。因此,我们的目的是探讨在肝癌细胞中CCAT1与自噬之间的关系。在当前的研究中,我们证实了CCAT1的表达水平在HCC组织中上调。并且我们发现CCAT1可以作为致癌基因影响增殖。此外,我们证明了CCTA1可以在HCC细胞的自噬中通过海绵效应吸附mi R-181a-5p来上调ATG7的表达。研究方法:1.人体组织样本:所有HCC组织及相邻的正常组织均来自中国医科大学附属肿瘤医院。手术后收集组织,然后立即在液氮中冷冻并储存在-80摄氏度直至提取总RNA。所有患者都签署了知情同意书,并通过了中国医科大学附属医院研究伦理委员会批准。2.细胞培养:人肝细胞癌细胞系(HCCLM3,Huh7,Hep3B,Hep G2)和正常肝细胞L02均购自中国科学院细胞库。细胞系均在含有10%胎牛血清(Invitrogen)和青霉素/链霉素(100U/ml)杜氏细胞培养基(DMEM,Gibco,Carlsbad,CA,USA)中培养。将所有细胞培养在37℃,5%CO 2的培养箱中。3.菌落形成试验:在将细胞接种于24孔板后,用pc DNA3.1-CCAT1和pc DNA3.1转染细胞。24小时后,每组收集约4000个细胞,并在37℃下接种于6孔板中12天。用结晶紫染色细胞,然后在显微镜下计数存活的菌落(每个菌落超过50个细胞)。重复实验三次。4.蛋白质印迹:收集细胞用于western blot,并在RIPA裂解缓冲液(Beyotime,中国)中裂解。将膜与特定的一抗孵育。抗体为ATG7,LC3,p62和β-actin(Cell Signaling Technology,USA)。用结合有辣根过氧化物酶(HRP)的第二抗体标记免疫印迹样品2小时,并使用Li-Cor odyssey蛋白成像系统显影。5.定量RT-PCR:通过TRIzol提取总RNA。RNA提取后,通过SYBR Premix Dimer Eraser重组酶进行实时定量PCR。使用2-ΔΔCt方法定量每个基因,并且将GAPDH视为内源参照基因。6.细胞转染:在大约80%的细胞生长聚集时进行细胞转染。使用Lipofectamine2000转染试剂(Gemma,Shanghai)将pc DNA3.1和pc DNA3.1-CCAT1(Gemma,Shanghai)转染到细胞中。7.细胞增殖:使用Cell Counting Kit-8(CCK8)进行细胞增殖。将细胞以每孔约2×10 4个细胞接种在96孔板中,并在生长培养基中培养。用CCK8测定法处理细胞,并在指定的时间点测量吸光度(450nm)。8.免疫荧光染色:先用4%多聚甲醛固定后洗涤,透性化处理后封闭,然后用抗-LC3m Ab进行过夜免疫染色,随后二抗孵育(Dy Light 488,Goat Anti-Rabbit Ig G),然后用DAPI(Beyotime)染色细胞核。最后,通过共聚焦显微镜(Nikon,Japan)观察所有染色的切片。9.透射电子显微镜:将样品组织固定-洗涤-固定后,梯度酒精脱水,环氧树脂浸透过夜、包埋,不同温度下聚合24 h,切片,进行铅铀染色,通过透射电镜进行观察并摄片。10.荧光素酶测定:使用生物信息学软件预测CCAT1与mi R-181a-5p基因的结合,设计并克隆突变后的CCAT1’-UTR序列和CCAT1’-UTR序列。向pmir GLO双荧光素酶报告载体构建CCAT1’-UTR双荧光素酶报告基因野生型载体(pmir GLO-CCAT1)及其突变载体(pmir GLO-mut-CCAT1)。通过PCR电泳鉴定重组载体。和基因测序证明重组载体成功构建。使用转染试剂lipofectamine TM 2000,用mi R-181a-5p模拟物或mi R-181a-5p阴性对照(Negative Control,NC)转染两种重组载体质粒,并通过双荧光素酶检测系统检测其活性。11.统计分析:使用SPSS 17.0(SPSS,USA)分析数据。结果表示为平均值±SD。使用双尾Student’s T检验比较两组差异,p值<0.05表示统计学意义的结果。结果:CCAT1的表达水平在HCC组织中上调,并促进HCC细胞的增殖和自噬,证实CCAT1在HCC细胞中诱导自噬。此外,CCAT1在自噬中调节ATG7,发现CCAT1和ATG7水平之间存在正相关。通过Westernblot显示增强的mi R-181a-5p抑制ATG7的表达,结合荧光素酶测定的结果表明CCAT1通过海绵效应吸附mi R-181a-5p调节自噬,进而增加ATG7的表达。结论:本研究证实CCAT1可作为HCC中一种新的潜在致癌基因,影响细胞增殖和自噬。此外,在CCAT1诱导自噬中促进了ATG7的表达。并且CCAT1通过直接结合影响mi R-181的作用。CCAT1可能是高度侵袭性HCC的新治疗靶点。