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番茄(Solanum lycopersicum L.)原产于南美洲,是世界上重要的蔬菜作物之一。番茄含有丰富的营养物质,如番茄红素、维生素、氨基酸等,在平衡人们饮食方面发挥着重要的作用。番茄植株易受多种病原菌(细菌、真菌、病毒)的危害,番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)由烟粉虱进行传播,严重危害着番茄的产量和品质。近年来,由于烟粉虱的大量爆发及难以预防和控制,对防治番茄TYLCV危害造成困难。目前已运用转录组、代谢组等组学方法分析了 TYLCV侵染番茄过程中的差异响应基因和代谢产物,但番茄响应TYLCV侵染的作用机制仍需进一步深入探究。本文通过分析番茄响应TYLCV侵染的转录组数据,鉴定到差异表达的转录因子,了解不同类型的转录因子在TYLCV侵染番茄过程中的表达模式;将筛选到的差异表达基因构入植物过表达载体并转入拟南芥、烟草、番茄中进行功能验证;利用蛋白双向电泳技术鉴定了不同抗性番茄品种侵染TYLCV中期的差异表达蛋白;在番茄中过表达了 M13噬菌体单链DNA结合蛋白基因HDP,鉴定了转基因和对照番茄侵染TYLCV的表型及病毒含量。主要研究内容和结果如下:1.通过分析番茄响应TYLCV侵染的转录组数据,筛选到22个差异表达的AP2/ERF转录因子。分析了 5个ERF-B3组转录因子基因(Soly19、Soly36、Soly66、Soly67、Soly106)在高抗番茄品种‘红贝贝’、抗性番茄品种‘浙杂301’和‘浙粉702,、感病番茄品种‘金棚1号’和‘仙客6号’侵染TYLCV的表达模式。互作网络分析表明番茄ERF转录因子可以和丝裂原活性蛋白激酶相互作用。利用酵母单杂交鉴定了 5个ERF-B3组转录因子结合GCC-box的能力,结果表明,这5个ERF-B3组转录因子结合GCC-box的能力在感病和抗病番茄品种中存在差异。2.在番茄中鉴定到6个响应TYLCV侵染的WRKYIII亚族转录因子(SolyWRKY41、SolyWRKY42、SolyWRKY53、SolyWRKY54、SolyWRKY80、SolyWRKY81)。亚细胞定位分析表明,SolyWRKY41和SolyWRKY54属于核蛋白。W-box等cis作用元件存在于番茄WRKYIII亚族转录因子的启动子区。番茄WRKYIII亚族转录因子基因在感病和抗性番茄侵染TYLCV中的表达水平存在差异。SolyWRKY41和SolyWRKY54沉默后的抗性番茄叶片中,TYLCV病毒含量显著低于对照番茄,表明SolyWRKY41和SolyWRKY54负调控TYLCV侵染。3.四个 NAC 转录因子基因(SlNAC20、SlNAC24、SlNAC47、SlNAC61)在抗病番茄品种‘浙杂301’侵染TYLCV后的表达水平增加。病毒诱导基因沉默表明SlNAC61在番茄响应TYLCV侵染过程中起着正调控的作用。番茄NAC转录因子不仅响应病原菌侵染,还参与了番茄生长发育和逆境胁迫过程。WRKY、TGA、MYB、NAC等转录因子可以通过结合NAC转录因子启动子区的cis元件调控NAC基因的表达。4.本文从番茄中克隆到一个响应TYLCV侵染的ATAF亚族转录因子基因SlNAC20。分析了 SlNAC20在激素、干旱、高盐处理后的表达模式,结果表明SlNAC20在干旱、高盐处理24 h后,表达量增加。SlNAC20可快速显著的响应SA、MeJA处理,SA处理lh后,其表达量增加了近60倍。初步探讨了SlNAC20基因在干旱胁迫下的作用,过表达SlNAC20基因的拟南芥植株自然失水率高于野生型拟南芥,且SOD、POD活性增加。酵母双杂交分析表明S1NAC20蛋白具有自激活现象,将SlNAC20进行拆分以消除自激活,但拆分后的蛋白与TYLCV的Ren无互作关系。同样将SlNAC20转化到烟草和番茄中,获得GUS染色阳性植株,用于后续TYLCV侵染和干旱、高盐等非生物胁迫功能验证。5.利用蛋白双向电泳技术(2-DE)鉴定了感病番茄品种‘金棚1号’和抗病番茄品种‘浙杂301’侵染TYLCV中期的差异表达蛋白。共鉴定到86个差异表达蛋白,根据蛋白功能将其分为7个组。PPO、CAB、HSC70等蛋白的表达模式在2-DE和RT-qPCR分析中存在差异。番茄-TYLCV侵染的作用网络图为了解番茄叶片细胞侵染TYLCV过程中的蛋白响应提供了重要的信息。6.为探究单链DNA结合蛋白在响应TYLCV侵染中的作用,在番茄中过表达了化学合成的M13噬菌体单链DNA结合蛋白基因smHDP。与对照番茄相比,转基因番茄侵染TYLCV症状有所缓解,转基因番茄中病毒含量在TYLCV侵染1～3周内显著低于对照番茄。smHDP转基因番茄植株诱导了 PRs、HSC70、APX、CAT等基因的表达。