第Ⅰ部分BAFF及BR3-Fc融合蛋白在ITP中的机制研究免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia, ITP)是由于机体免疫失耐受,产生的抗血小板自身抗体与血小板表面特异性抗原结合,导致血小板在网状内皮系统过度破坏引起血小板减少。由自身反应性B细胞产生的自身抗体,主要是针对自身血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa和／或Ⅰb／Ⅸ抗原的自身抗体,尤其是IgG抗体,在ITP的发病中起到重要的作用。此外,多种细胞免疫机制异常,如Th1极化、调节性T细胞数目降低或者抑制功能缺陷、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介导的血小板破坏等在ITP的发病中发挥重要作用。到目前为止,出现上述异常的原因尚未明确。ITP的主要治疗包括糖皮质激素、免疫球蛋白、抗-D和脾切除等,但仅有1／3的患者能够获得长期缓解。B细胞活化因子(B-cell activating factor, BAFF,亦称为BlyS,TALL-1,THANK, zTNF4 and TNFSF13B)是近年来发现的肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor super family, TNFSF)的新成员,它在B细胞发育、稳定及其自身反应性和T细胞共刺激等方面起到重要的作用。此外,BAFF在Th1介导的炎症应答中也起到重要的作用。目前研究发现BAFF主要与三个受体结合,B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen, BCMA,亦称TNFRSF17)、转膜激活剂、钙调节剂和亲环素配体相互作用物(transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand interactor, TACI,亦称TNFRSF13B)和BAFF受体(BAFF receptor, BAFF-R,亦称BR3, TNFRSF13C)。BR3是B细胞存活最主要的受体,它广泛表达于包括未成熟B、过渡期B、成熟B、记忆B、生发中心B以及浆细胞在内的B细胞亚群。此外,体内和体外研究表明,表达于T细胞上的BR3与BAFF结合后能够刺激T细胞的增殖。许多研究表明,BAFF在自身免疫中发挥重要的作用。自身抗原结合的B细胞对BAFF介导的存活信号依赖增强。在许多自身免疫性疾病患者中,如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、干燥综合征(Sjogren’s syndrome, S S)、多发性硬化(multiple sclerosis,MS)等,血浆BAFF表达水平异常升高。抑制BAFF信号通路可能是B细胞介导的自身反应性疾病一种有效的治疗方法。动物实验和临床试验研究表明应用BAFF阻断剂(如TACI-Ig,BAFF-R-Ig,BR3-Fc)阻断BAFF在某些自身免疫性疾病中是一种有效的治疗手段。目的：检测ITP患者BAFF表达以及rhBAFF和BR3-Fc对B细胞、T细胞、血小板、干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)的作用,探讨BAFF和BR3-Fc在ITP发病中的可能机制方法：◆BAFF检测部分抽取25例活动性ITP患者,20例稳定期患者和24例对照的外周血,分离血浆和单个核细胞◆酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunoadsorbent assay, ELISA)法和实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR检测BAFF蛋白和mRNA水平；改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(immobilization of platelet antigens magnetic activated cell separation, MAIPA)检测抗GPIIb/Ⅲa和GPIb/IX自身抗体◆体外部分抽取18例活动性ITP患者和15例对照的外周血15ml,分离单个核细胞和血小板,加入不同的细胞因子共同培养,分为3组：1640组(Ⅰ组)、rhBAFF 20ng／ml组(Ⅱ组)和rhBAFF+BR3-Fc组(Ⅲ组)。流式细胞术检测CD19+B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及血小板的凋亡；ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4和自身抗体的表达结果：◆BAFF在活动性ITP中表达升高,稳定期患者与对照无显著性差异在活动性ITP患者中BAFF蛋白水平(均值±标准差,593.1±219.0 pg/ml)明显高于稳定期患者(432.5±121.4pg/ml, P<0.05)和正常对照(454.4±132.5pg/ml,P<0.05)。活动性ITP患者BAFF mRNA水平是稳定期患者和对照的3.1倍(P<0.01)和2.5倍(P<0.01)。而在稳定期患者无论BAFF蛋白还是mRNA水平均与正常对照无明显差异(P>0.05)。BAFF水平与GPIIb/IIIa和GPIb/Ⅸ无显著性相关。◆RhBAFF促进CD19+存活,BR3-Fc纠正rhBAFF对其影响RhBAFF降低ITP患者CD19+细胞的凋亡(Ⅱ组：7.0±4.3％vsⅠ组：13.2±7.4％,P<0.05),加入BR3-Fc后CD19+细胞的凋亡升高,但与1640组无显著性差异(Ⅲ组：11.2±4.1％vsⅠ组：13.2±7.4%,P>0.05)。◆RhBAFF促进CD8+存活,BR3-Fc纠正rhBAFF对其影响ITP患者中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组CD8+细胞的凋亡率分别为6.5±3.2％,4.4±2.2％和6.3±2.9%。RhBAFF促进CD8+存活,BR3-Fc纠正rhBAFF对其影响。◆RhBAFF和BR3-Fc对CD4+细胞凋亡无显著影响RhBAFF对CD4+细胞凋亡无显著影响。ITP患者中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组CD8+细胞的凋亡率分别为8.6±4.5％,5.3±1.8％和8.2±3.8％。◆RhBAFF促进血小板凋亡,BR3-Fc抑制其凋亡RhBAFF促进ITP患者血小板的凋亡(Ⅱ组：8.4±4.9％vsⅠ组：3.2±1.0％,P<0.051,加入BR3-Fc后血小板的凋亡降低(Ⅲ组：5.0±3.0％vsⅡ组：8.4±4.9％,P<0.05)。此外,我们应用线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测血小板凋亡进一步验证了我们的结果。◆在ITP患者中各组IFN-γ均显著高于对照组,rhBAFF促进ITP患者IFN-γ分泌,而BR3-Fc抑制其表达ITP患者中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组IFN-γ分别为74.0±12.5pg／ml、95.1±25.7pg／ml和82.4±17.4pg/ml, rhBAFF 20ng／ml组IFN-γ水平显著高于1640组,加入BR3-Fc后IFN-γ表达下降。IL-4低于最低检测值。结论：◆BAFF在活动性ITP的表达升高,而稳定期患者无异常,与病情变化相关。◆BAFF可能通过促进CD19+B和CD8+T细胞存活、促进血小板的凋亡、促进Th1类细胞因子分泌等机制在ITP的发病中起到重要的作用；BR3-Fc纠正了rhBAFF对上述细胞和因子的作用。◆阻断ITP中过高的BAFF可能成为ITP治疗的一个新的靶点。第Ⅱ部分大剂量地塞米松疗法抑制ITP患者BAFF的表达ITP的治疗主要有糖皮质激素、免疫球蛋白、脾切除、达那唑及免疫抑制剂等,其中糖皮质激素是ITP的一线治疗药物。在过去50多年里,泼尼松一直是治疗ITP的首选,开始剂量1.0-1.5mg／kg/d,分次口服4-6周,此后逐渐减量至血小板在安全水平以上(血小板>30x109／L)的最低用量时给予维持治疗,约70％患者可获得缓解,而30％患者治疗无效,属于难治性ITP。该方法治疗有效率与剂量相关,长期应用副作用较大,并且减量过程中容易复发,此时给予重复治疗很难再取得持续缓解,应考虑换用其他治疗。脾切除是泼尼松治疗失败患者的第一选择,其长期缓解率为50％-70％,仍然有30％左右患者治疗无效,另外还有部分泼尼松治疗失败的患者由于年龄、基础疾病等因素而不能行脾切除手术治疗,这些难治性ITP患者的治疗一直是临床上非常棘手的问题。近年来大剂量地塞米松(High dose dexamethasone, HD-DXM)疗法较传统的强的松治疗取得了更好的疗效。与泼尼松相比,HD-DXM冲击治疗起效快、副反应轻微,效果相当于免疫球蛋白,但是花费明显减少。对于初诊的ITP患者,HD-DXM冲击治疗效果显著,80％以上有治疗反应,已经作为一线治疗选择。对于复发／难治性ITP患者HD-DXM冲击治疗总体有效率不高,只有部分患者有治疗反应。HD-DXM冲击治疗尚不能代替或避免脾切除,不过可以作为脾切除前的应急准备。研究表明在某些自身免疫性疾病中如SLE、大疱性类天疱疮中糖皮质激素能够显著降低患者BAFF表达水平。另一项研究表明DXM在体外能够抑制风湿性关节炎患者纤维母样滑膜细胞BAFF的表达,并且呈剂量和时间依赖性。而关于HD-DXM对ITP患者BAFF表达的影响目前尚未见报道。目的：研究大剂量地塞米松(HD-DXM)对ITP患者BAFF的作用,进一步探讨HD-DXM在ITP治疗中的可能机制方法：◆留取20例ITP患者(应用激素治疗前2周各抽血一次)和24例对照的外周血3ml。分离血浆和单个核细胞。ELISA检测血浆BAFF蛋白水平,实时定量PCR检测PBMCs中BAFF mRNA水平。◆其中10例ITP患者和14例对照抽血15ml,分离单个核细胞。加入不同浓度DXM,培养后分离上清检测BAFF、IFN-γ和IL-4,分离细胞实时定量PCR检测BAFF mRNA水平。CCK-8法检测淋巴细胞增殖。结果：◆HD-DXM临床疗效80％患者(16／20)获得长期反应,15％患者(3／20)获得部分反应,5％患者(1／20)无反应。HD-DXM治疗2周后平均血小板数目是165×109／L(范围23-332×109/L)。◆BAFF在活动性ITP(应用HD-DXM治疗前)明显升高,应用HD-DXM后,ITP患者BAFF水平明显降低活动性ITP患者中BAFF蛋白水平及其mRNA水平显著升高。应用HD-DXM后,ITP患者BAFF蛋白水平(均值297pg／ml,范围184-545pg/ml)明显低于用药前(均值597 pg／ml,范围300-1026pg/ml)和正常对照(均值454 pg／ml,208-804pg/ml, P<0.001); BAFF mRNA水平亦明显低于激素前患者(P<0.001)和对照组(P<0.001)。◆BAFF变化与HD-DXM治疗反应密切相关应用HD-DXM后,20例患者中有18例BAFF水平明显低于治疗前水平,1例患者BAFF水平与治疗前相比无明显降低,1例BAFF水平略微升高。这两例患者均对HD-DXM治疗无反应,后来随访发现为难治性ITP,并进行脾切除。◆DXM体外抑制BAFF的表达我们体外培养10例未治疗的ITP患者和11例对照PBMCs,加入不同浓度的DXM后体外培养72小时,我们发现DXM明显抑制BAFF的表达,并且呈剂量依赖性。◆DXM体外抑制IFN-γ的表达我们体外培养ITP患者和对照PBMCs,加入不同浓度的DXM(OnM,7.8nM, 15.6nM,31.3nM,62.5nM,125nM,250nM1和10μg/ml PHA,于37℃含5％CO2孵箱孵育72小时后,收集上清,ELISA检测IFN-γ和IL-4表达,DXM能够显著抑制IFN-γ表达,并且呈剂量依赖性,而IL-4水平低于最低检测值。◆DXM体外抑制淋巴细胞的增殖CCK-8法检测DXM对淋巴细胞增殖的影响,我们发现DXM明显抑制淋巴细胞增殖,并且呈剂量依赖性。◆BAFF与ITP患者临床实验室指标相关性分析BAFF水平和血小板数目无显著性相关,且BAFF水平的变化和血小板数目的改变无显著性相关。结论：◆HD-DXM抑制ITP患者血浆BAFF及其mRNA水平的表达；◆DXM体外抑制BAFF、IFN-γ的表达和淋巴细胞的增殖。第Ⅲ部分白介素-21在ITP中的作用及其机制研究白介素-2家族主要包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15,在促进和维持T淋巴细胞群中起主要作用。由这些细胞因子介导的详细的分子信号传递途径尚未完全澄清.然而JAK/STAT,MAPK和P13这三个主要的途径已经清楚。IL-21是IL-2家族的新成员,主要由活化的CD4+T细胞和自然杀伤T细胞表达,除此以外,近来发现IL-21还可以由Th17细胞表达。IL-21／IL-21R信号在天然免疫和获得性免疫应答中均起到重要的作用,它能够促进T细胞介导的体液免疫应答与抗体生成、增强NK细胞的自然杀伤能力、促进Th细胞向Th17细胞的分化、影响Th细胞向Th1／Th2细胞的分化等。在许多自身免疫性疾病中(如SLE,RA,SS等)IL-21和／或IL-21R表达异常。目前,未见关于IL-21／IL-21R在ITP患者中的报道。目的：通过对ITP患者外周血中表达IL-21的细胞亚群和Th17、Th1、Tc1细胞亚群的检测,探讨IL-21在ITP中的作用及可能机制材料与方法：◆病例及正常对照的选择：活动性ITP患者26例,均符合ITP的诊断标准。正常对照21例,均为健康志愿者,无感染、无病毒性肝炎、无免疫性疾病及半年内未使用免疫抑制剂、抗HIV抗体阴性、肝肾功能正常,其年龄和性别均与ITP患者相匹配。◆应用三色流式细胞术检测ITP患者和正常对照外周血中各细胞亚群的比例。三种细胞亚群的界定分别为：表达IL-21的细胞为CD3+CD8-IL-21+和CD3+CD8+IL-21+,Th17细胞为CD3+CD8-IL-17A+,Th1细胞为CD3+CD8-IFN-γ+,Tc1细胞为CD3+CD8+IFN-γ+◆应用ELISA技术检测ITP患者和正常对照血浆中IL-21的表达水平。◆应用改良的MAIPA技术(单克隆抗体特异性俘获血小板抗原技术)测定ITP患者体内的抗血小板膜GPⅡb／Ⅲa和Ib／Ⅸ自身抗体。结果：◆IL-21在ITP中表达升高我们应用流式细胞术检测ITP患者外周血中IL-21的表达,发现IL-21表达于CD3+CD8-细胞和CD3+CD8+细胞上。ITP患者中CD3+CD8-IL-21+细胞亚群(4.4±0.8％)比例显著高于对照组(2.3±0.8％,P<0.001),相似的,ITP患者中CD3+CD8+IL-21+细胞亚群(0.8±0.5％)比例显著高于对照组(0.5±0.3％,P<0.05)。我们应用ELISA法检测ITP患者和对照血浆中IL-21的表达,我们发现ITP血浆IL-21水平(148.3±124.2pg／ml)高于对照组(78.0±32.0pg／ml,P<0.05)。◆ITP患者中Th17、Th1、Tc1细胞亚群表达升高ITP患者外周血Th17细胞的比例(2.1±0.8％)明显高于正常对照组(1.2±0.5％,P<0.05)。ITP患者外周血Thl细胞的比例(18.6±2.3％)明显高于正常对照组(10.9±2.6％,P<0.001),并且ITP患者Tc1细胞的比例(21.4±8.4％)较正常对照组(11.4±3.8％)亦显著升高(P<0.001)。◆各细胞亚群的相关性分析在ITP患者中,CD3+CD8-IL-21+细胞与Th17细胞(P<0.01)和Thl细胞(P<0.01)存在明显的正相关,而CD3+CD8+IL-21+细胞与Tc1细胞不存在相关性(P>0.05)。◆抗血小板自身抗体与各细胞亚群的相关性分析应用MAIPA法检测抗血小板自身抗体,并与各细胞亚群进行相关性分析,我们发现自身抗体与各个细胞亚群均不存在相关性(P>0.05)。结论：◆ITP患者中IL-21表达升高；◆在ITP患者中,CD3+CD8-IL-21+细胞与Th17细胞和Th1细胞存在明显的正相关,提示CD3+CD8-IL-21+细胞、Th17细胞和Th1细胞可能通过相互作用而在ITP的发病中起到协同作用。