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放射性颌骨坏死（osteoradionecrosis of jaws,ORNJ）是头颈部恶性肿瘤放射治疗最严重的并发症之一,常引起剧烈疼痛、感觉障碍以及张口、吞咽、咀嚼困难等一系列症状,还可导致皮肤、黏膜瘘的形成甚至病理性骨折的发生,严重影响患者的生活质量。现有的诸如高压氧治疗、手术治疗等方法均无法达到完全满意的治疗效果,使ORNJ成为困扰临床工作者的一大难题。目前,ORNJ的发病机制尚未得到完全阐明,但是越来越多的研究者倾向于认为ORNJ是一种放射性纤维萎缩性疾病（radiation-induced fibrosis,RIF）,在ORNJ的发病过程中,肌成纤维细胞（myofibroblasts,MFB）的过度分化和异常增殖发挥了重要作用。以转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）为代表的众多细胞因子与MFB的分化及纤维化形成密切相关,在多种纤维化疾病过程中诱导了MFB的活化和纤维性细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度分泌。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨组织内存在最为广泛的干细胞,具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,是正常骨稳态维持和骨修复的重要细胞来源。但是BMSCs在ORNJ发病的过程中的损伤作用以及BMSCs损伤与ORNJ发病之间的关联目前尚未有较为系统的研究。MFB的分化是ORNJ的特征性表现之一,已有研究证实成纤维细胞是MFB的主要来源之一,但是BMSCs作为骨组织中存在最为广泛的多分化潜能干细胞是否也参与了ORNJ中MFB的分化目前尚较少有文献报道。NOX4是重要的促纤维化细胞因子,NOX4介导的氧化应激压力升高可促进MFB分化和纤维化形成,在多种器官的纤维化疾病中发挥重要作用。那么在ORNJ的发生发展过程中NOX4发挥了怎样的作用,及其与TGF-β1之间的上下游关系究竟如何?为解答上述疑问,我们通过以下三部分实验开展了研究:第一部分、实验模型的建立以及放射线对大鼠BMSCs电离辐射效应的研究目的:建立ORNJ大鼠实验动物模型和大鼠BMSCs放射损伤模型,摸索较为理想的射线加载剂量,明确BMSCs的电离辐射损伤效应以及在ORNJ发病中的作用。方法:对6月龄雄性SD大鼠拔牙后根据等效公式分五次加载累计35Gy剂量射线,分别对其进行大体解剖学、影像学分析、组织学观察、Masson染色、α-SMA和I、III型胶原免疫组化染色、以及BMP-2、ALP、Runx2的western-blot检测。对P3代SD大鼠BMSCs分别设置空白对照组和2、4、6、8Gy梯度剂量放射组进行放射线干预。通过光学显微镜、CCK8法和Tunel法观察和检测各剂量条件下细胞形态改变、增殖能力和凋亡水平,并从中挑选适合的放射剂量。再用选取的剂量对BMSCs进行照射,通过western-blot和免疫荧光技术进一步观察细胞中TGF-β1、α-SMA、NOX4、III型胶原以及BMP-2、ALP、Runx2合成和分泌量。结果:（1）成功建立大鼠ORNJ实验动物模型和大鼠BMSCs细胞实验模型;（2）ORNJ组织呈现骨质破坏、纤维组织增生、MFB分化、胶原纤维分泌增多等特点;（3）大鼠BMSCs受到射线照射后可出现细胞形态改变、增殖抑制和凋亡增多,且呈现剂量依赖性;（4）4Gy剂量条件下细胞出现较为明显的电离辐射损伤现象,并可保留较为充足的细胞,可作为较理想的建模放射剂量;（5）BMSCs接受照射后TGF-β1、α-SMA、NOX4和III型胶原合成显著升高,但是BMP-2、ALP、Runx2没有明显改变。结论:（1）4Gy剂量为加载条件可造成大鼠BMSCs较为明显的细胞损伤,并可留存足够的活细胞用于后续实验,可作为细胞放射损伤研究较为理想的放射加载条件;（2）放射线会导致BMSCs发生形态改变、增殖抑制、凋亡增多等一系列细胞损伤,明确了BMSCs在受到射线照射后会发生电离辐射损伤特点;（3）放射会导致BMSCs中TGF-β1、α-SMA、NOX4、III型胶原合成和分泌水平显著升高等功能改变,与ORNJ的病理特点高度契合,提示BMSCs作为效应细胞参与了ORNJ的发生和发展;（4）放射会导致模型动物骨质破坏,但是并未造成BMSCs表达BMP-2、ALP、Runx2的大幅下降,综合细胞损伤实验结果,提示放射造成的骨质破坏可能是由其他原因造成的。第二部分、TGF-β1在放射所致BMSCs细胞损伤和功能改变中作用的研究目的:明确TGF-β1造成BMSCs细胞损伤和功能改变的能力,以及TGF-β1在BMSCs放射性损伤中的作用。方法:将细胞分为（1）空白对照组（不施加干预）;（2）单纯照射组（4Gy射线照射）;（3）外源性TGF-β1组（重组TGF-β1）;（4）沉默TGF-β1照射组（si RNA沉默TGF-β1表达并进行照射）并进行相应干预,通过光学显微镜、CCK8法和Tunel法观察并检测各组细胞形态改变、增殖能力和凋亡水平,通过western-blot和免疫荧光技术观察细胞中TGF-β1、α-SMA、NOX4、III型胶原以及BMP-2、ALP、Runx2等的合成和分泌量。结果:（1）外源性TGF-β1可造成BMSCs发生形态改变、增殖抑制和凋亡增多等细胞损伤现象;（2）外源性TGF-β1可造成BMSCs中α-SMA、NOX4、III型胶原合成和分泌水平的显著升高等功能改变;（3）沉默TGF-β1表达可明显减轻放射线所导致的BMSCs细胞损伤和功能改变。结论:（1）TGF-β1可造成BMSCs发生细胞损伤现象和功能改变;（2）TGF-β1造成的BMSCs细胞损伤现象和功能改变与放射线所造成的相类似;（3）抑制TGF-β1功能可减轻BMSCs的上述损伤和改变;（4）TGF-β1作为放射线导致BMSCs发生细胞损伤和功能改变的关键环节参与了ORNJ发病中BMSCs的改变;（5）TGF-β1可作为ORNJ临床防治的潜在靶点。第三部分、NOX4在TGF-β1介导的BMSCs细胞损伤和功能改变中作用的研究目的:明确NOX4在放射所导致的BMSCs细胞损伤和功能改变中的作用,探讨TGF-β1与NOX4在上述作用中的上下游关系,揭示TGF-β1导致ORNJ中BMSCs损伤的分子机制,并对以NOX4为靶点的抑制剂应用在ORNJ临床预防中的可行性进行初步探索。方法:将细胞分为（1）空白对照组（不施加干预）;（2）单纯照射组（4Gy射线照射）;（3）外源性TGF-β1组（重组TGF-β1）;（4）沉默NOX4照射组（si RNA沉默NOX4表达+照射）;（5）沉默NOX4外源性TGF-β1组（si RNA沉默NOX4表达+重组TGF-β1）并进行相应干预。将实验大鼠分为（1）空白对照组（仅拔牙）;（2）单纯照射组（进行标准建模剂量照射）;（3）NOX4抑制剂照射组（GKT137831灌胃+标准建模剂量照射）。通过光学显微镜、CCK8法和Tunel法观察和检测各组细胞形态改变、增殖能力和凋亡水平;通过western-blot和免疫荧光技术观察细胞中TGF-β1、α-SMA、NOX4、III型胶原及BMP-2、ALP、Runx2等的合成和分泌量;在大体、影像、组织等多个层面对相关指标进行检测,重点观察NOX4抑制剂的应用对ORNJ纤维化症状的改善作用。结果:（1）过表达NOX4可造成类似于放射线和外源性TGF-β1所造成的BMSCs细胞形态改变、凋亡增多、增殖抑制等细胞损伤,以及α-SMA、NOX4和III型胶原合成和分泌的显著升高等功能改变;（2）沉默NOX4表达可对放射线所造成的上述细胞损伤和功能改变起到明显的改善作用;（3）沉默NOX4可明显缓解TGF-β1造成的上述细胞损伤和功能改变;（4）过表达和沉默NOX4表达对BMSCs中BMP-2、ALP、Runx2等的合成和分泌量均不造成明显改变;（5）使用NOX4抑制剂可有效改善大鼠ORNJ纤维化症状的严重程度。结论:（1）NOX4表达的升高是BMSCs电离辐射损伤和功能改变的重要环节;（2）NOX4表达的升高是TGF-β1致BMSCs细胞损伤和功能改变的重要蛋白;（3）NOX4是TGF-β1介导的放射致BMSCs向MFB分化以及胶原分泌的关键环节;（4）NOX4并非BMSCs中BMP-2、ALP、Runx2等调控的关键因素;（5）NOX4可作为ORNJ临床预防的潜在靶点,具有较好的应用前景。综上,本研究通过建立基于医用放疗机的SD大鼠实验动物模型和BMSCs细胞辐照模型,摸索出了具有较好应用价值的建模方法;明确了BMSCs在ORNJ发病过程中的细胞损伤特点,及其作为ORNJ发生发展中的效应细胞在MFB分化、TGF-β1合成、NOX4表达、ECM分泌等方面的作用;明确TGF-β1诱导了ORNJ发病过程中BMSCs细胞增殖能力下降、凋亡增多等细胞损伤以及MFB分化、NOX4表达上调、ECM分泌等功能改变;探明了NOX4作为TGF-β1的下游环节参与了TGF-β1介导的BMSCs细胞损伤和功能改变;初步探索了以NOX4为靶点的抑制剂应用对ORNJ的预防作用。本研究可为研究基于保护BMSCs的ORNJ防治策略和以NOX4为靶点的ORNJ预防研究提供理论依据和新思路。