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背景和目的PPAR是一组核受体超家族成员,有PPARα、δ或β、γ三种亚型。目前关于PPARα和PPARγ的结构和功能基本上已经明确。但是PPARδ作为最后鉴定的PPAR,其功能目前尚无深入研究。研究发现,PPARδ分布相当广泛,在胰岛、心肌、骨骼肌、脂肪组织、皮肤、脑组织中均有较高表达。研究还发现在骨骼肌、心肌、脂肪组织中,PPARδ均能够增强脂肪酸的氧化和利用,是脂肪酸氧化酶的上游调节因子。因此PPARδ被看作代谢综合征的新的强有力的治疗靶点。但是也有研究发现,在巨噬细胞中PPARδ能够促进胆固醇内流和脂质沉积。这些研究提示PPARδ在脂质代谢中的作用可能具有组织特异性。脂毒性导致的胰岛β细胞功能障碍是代谢综合征发病的中心环节之一,改善胰岛β细胞脂代谢可能对代谢综合征的防治起着重要作用。虽然目前有较多的提示性证据表明PPARδ可能在调节胰岛β细胞脂代谢和胰岛素分泌中起作用,但是其在胰岛β细胞中的确切功能却无直接的实验研究报道。为此我们采用Adeasy系统,构建了PPARδ、PPARδ显性负性突变体PPARδ-DN、PPARδ-shRNA的腺病毒载体,观察了它们对INS-1细胞脂代谢相关酶的表达、细胞内甘油三酯浓度、胰岛素释放及相关基因表达的影响,以期明确PPARδ对胰岛β细胞脂代谢和胰岛素分泌的影响及初步机制。方法1.在葡萄糖浓度分别为3 mmol/L、11 mmol/L、20 mmol/L培养条件下,分别用RT-PCR和western blot检测PPARδmRNA和蛋白的表达变化。2.在软脂酸浓度分别为0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L培养条件下,分别用RT-PCR和western blot检测PPARδmRNA和蛋白的表达变化。3.采用Adeasy系统,构建PPARδ和PPARδ的显性负性突变体PPARδ-DN的重组腺病毒载体。4.在构建了PPARδsiRNA表达质粒的基础上,采用Adeasy系统构建PPARδ-shRNA的重组腺病毒载体。5.分别用PPARδ腺病毒、PPARδ-DN腺病毒、PPARδ-shRNA腺病毒感染INS-1细胞,RT-PCR检测其对INS-1细胞脂代谢相关基因ACO、CPT1、FATP1、LCAD表达的影响。同时检测细胞内甘油三酯浓度;6.分别用PPARδ腺病毒、PPARδ-DN腺病毒、PPARδshRNA腺病毒感染INS-1细胞,RT-PCR检测它们对INS-1细胞Preproinsulin基因表达和放免法检测它们对INS-1细胞胰岛素释放的影响。7.分别用PPARδ腺病毒、PPARδ-DN腺病毒、PPARδshRNA腺病毒感染INS-1细胞,RT-PCR分别检测它们对GLUT2、PDK4、UCP-2 mRNA表达的影响。结果1. INS-1细胞的PPARδmRNA及蛋白表达随着葡萄糖浓度的升高而逐渐降低;2. INS-1细胞的PPARδmRNA及蛋白表达随着软脂酸浓度的升高而逐渐升高。3.成功构建了PPARδ和PPARδ的显性负性突变体PPARδ-DN的腺病毒载体。4.成功构建了PPARδ的siRNA表达载体,并在此基础上,成功构建了PPARδ-shRNA腺病毒表达载体。5. PPARδ腺病毒感染INS-1细胞后,INS-1细胞脂代谢相关基因ACO、CPT1、FATP1、LCAD的表达明显升高,细胞内甘油三酯含量明显降低。而PPARδ-DN腺病毒、PPARδ-shRNA腺病毒感染INS-1细胞后,ACO、CPT1、FATP1、LCAD的表达明显降低,细胞内甘油三酯含量明显升高。6. PPARδ腺病毒感染INS-1细胞后,INS-1细胞培养基中胰岛素含量明显减少,Preproinsulin表达明显下降。而PPARδ-DN腺病毒、PPARδ-shRNA腺病毒感染INS-1细胞后,INS-1细胞培养基中胰岛素含量明显上升,Preproinsulin表达明显增高。7. PPARδ腺病毒感染INS-1细胞后,UCP-2、PDK4的表达明显升高, GLUT2的表达明显下降。而PPARδ-DN腺病毒、PPARδshRNA腺病毒感染INS-1细胞后,UCP-2、PDK4的表达明显下降,而GLUT2的表达明显增高。结论1. INS-1细胞中,葡萄糖是PPARδ表达的负向调控因素,而脂肪酸是PPARδ表达的正向调控因素。提示PPARδ在胰岛β细胞的糖脂代谢中起着重要作用。2. PPARδ能够促进胰岛β细胞的脂肪酸氧化,减少胰岛β细胞内的甘油三酯沉积,从而可能减轻胰岛β细胞的脂毒性。3. PPARδ能够抑制胰岛β细胞的胰岛素分泌。PPARδ抑制胰岛β细胞胰岛素分泌的机制可能包括增强UCP-2、PDK4和下调GLUT2的表达。4. PPARδ对胰岛功能的影响可能是多方面的:首先,PPARδ促进胰岛β细胞的脂肪酸氧化,减少胰岛β细胞内的甘油三酯沉积,从而可能减少胰岛β细胞的脂性凋亡;其次,PPARδ能够降低胰岛素分泌从而可能防止长期高脂条件下的胰岛β细胞功能耗竭。最后,在短期内,PPARδ抑制胰岛β细胞胰岛素分泌,这也可能加重胰岛β细胞的糖毒性。因此,PPARδ对胰岛β细胞功能的影响需要进一步的长期的观察。