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顺铂作为临床上使用最为广泛的抗癌药物之一,其疗效主要是由于顺铂与细胞内DNA以共价结合的方式形成1,2-GG和1,2-AG链内交联产物,阻断了DNA的转录和复制,最终导致癌细胞凋亡。但顺铂严重的毒副作用,以及大部分癌细胞对顺铂存在固有的或获得的抗药性,极大的限制了顺铂在临床上的进一步使用。因此设计合成新型的具有高效低毒的铂类抗癌药物成为当前的热点。多核铂配合物由于在结构上打破了经典的构效关系,而且能与DNA形成完全不同于顺铂的长程交联加合物,因此有望展现与顺铂不同的抗瘤谱,成为新一代的抗肿瘤试剂。多核配合物的结构.抗肿瘤活性之间的构效关系对于药物的合理设计与合成具有非常重要的意义。
目前人们所报道的多核铂配合物,多为柔性脂肪胺为桥联配体,或以刚性的吡唑环为桥联配体,有关刚性-柔性兼具的多核铂配合物的研究鲜有报道。本课题组设计并合成的一系列在柔性链中导入刚性结构的多核铂配合物,对顺铂敏感及产生抗药性的细胞株都表现出比顺铂更高的抗肿瘤活性。迄今为止,这类刚性-柔性兼具的多核铂配合物的结构-抗肿瘤活性的构效关系还未曾被探讨过。
本论文分别从“多核铂中心”和“桥联配体”这两个方面比较了“多核铂配合物结构-DNA结合方式-抗肿瘤活性”之间的构效关系。采用聚丙烯酰胺电泳、Maxam-Gilbert测序、MALDI-TOF MS、酶切分析等多种分子生物学技术,以及分子动力学模拟,对多核铂配合物与DNA的作用方式进行了详细的表征。
新型三核铂类抗肿瘤配合物[Pt3(HPTAB)Cl3](ClO4)3(I,HPTAB=N,N,N,N,N",N"-hexakis(2-pyridylmethyl)-1,3,5-tris(aminomethyl)benzene),和其双核类似物[Pt2(mTPXA)Cl2]Cl2(II,mTPXA=N,N,NN]-tetra(2-pyridylmethyl)-m-xylylene diamine)相比,具有很强的DNA结合能力,且对顺铂敏感及产生抗药性的细胞株都表现出比顺铂更高的抗肿瘤活性。由此,我们比较了二者的“多核铂中心-DNA结合方式-抗肿瘤活性之间的构效关系。
研究表明,配合物Ⅰ与DNA的结合方式有很多新颖之处:(一),不但能形成1,3-和1,4-GG链内交联加合物,更能形成独特的链间交联三加合物,这是文献中未曾报道过的。而配合物Ⅱ主要以1,4-GG链内交联方式与DNA结合。配合物Ⅰ的多种DNA交联方式与其第三个铂中心密切相关,在与DNA结合过程中多核铂中心起到了协同作用。结合CD光谱推测,当配合物Ⅰ中两个铂中心与鸟嘌呤G结合后,诱导DNA构象改变,使其有利于第三个铂中心与DNA结合,最终形成链间交联三加合物。(二),在外切酶ExoⅢ的酶切分析中,第一次报道了配合物Ⅰ形成的Pt-DNA加合物能使酶切反应停止在铂化位点互补链的前一个碱基上;和顺铂和反铂的加合物不一样,其酶切停止在铂化位点的前一个碱基上;而且对于配合物Ⅱ,外切酶可以绕过第一个铂化的碱基,停止在第二个铂化位点互补链的前一个碱基上。这说明配合物Ⅰ的加合物使铂化位点附近的双链DNA构象严重变形,从而较早的阻止了酶切反应的进行。(三),分子动力学模拟中,观察到配合物Ⅰ的1,3-链内交联和链间交联三加合物使DNA向小沟方向弯曲51°58°,也和顺铂1,2-GG链内交联加合物使DNA向大沟方向弯曲的性质完全不同,对克服NER核酸修复系统中的蛋白识别和剪切等起到了重要的作用,这一特性为配合物Ⅰ克服顺铂抗药性提供依据。总之,多核铂配合物不但提供了多种Pt-Pt距离,为配合物以多种结合方式与DNA交联提供可能;而且多核铂中心可能存在协同作用,可通过多核铂中心的理性调控来促成多种DNA结合方式的形成,从而提高多核铂配合物的生物活性。
一种以4,4-二胺二苯基甲烷为桥联配体的双核铂(Ⅱ)配合物{[cis-Pt(NH3)2Cl]2L1}(NO3)2(Ⅲ,L1=4,4-methylenedianiline),和以1,4-二(氨甲基)苯为桥联配体的双核铂(Ⅱ)配合物([cis-Pt(NH3)2Cl]2L2}(NO3)2(Ⅳ,L2=α,a-diamino-p-xylene),都是单功能的1,1/c,c型双核铂配合物,具备良好的水溶性。但Ⅲ具备DNA结合能力强、低的水解趋势、与5-GMP作用快速以及比顺铂更高的细胞毒活性等优点。由此,我们比较了二者的“桥联配体-DNA结合方式-抗肿瘤活性之间的构效关系。
结果表明,配合物Ⅲ很容易形成等量的1,3-和1,4-GG链内交联产物;而配合物Ⅳ主要形成1,4-链内交联。酶切分析结果表明,Ⅲ使酶切反应停止的位点比配合物Ⅳ早两个碱基。Ⅲ使酶切反应停在第二个铂化位点G对应的互补链碱基上;对于Ⅳ,外切酶则绕过了两个铂化的G,最终停止在1,4-链内交联加合物前,进一步说明配合物Ⅳ中极少量的1,3-链内交联加合物。从结构上分析,Ⅲ配体中两个苯环由亚甲基连接,柔韧性更强;而Ⅳ以二(氨甲基)苯为桥联配体,刚性更强。由此可见,由于桥联配体的的长度和柔韧性不同,导致配合物与DNA结合方式不同,最终表现出不同的抗肿瘤活性。
总结“多核铂配合物的结构-DNA结合方式-抗肿瘤活性”之间的构效关系,为设计具备低毒、良好水溶性且保持克服顺铂抗药性能力的新多核铂类抗肿瘤药物提供理论指导。
另外,虽然顺铂与DNA的作用位点和作用方式已很明确,即主要以1,2-GG和1,2-AG链内交联的方式形成Pt-DNA加合物,但其对DNA序列的选择性目前还不清楚。而顺铂的抗癌作用机理以及某些癌细胞对顺铂固有的抗药性可能牵涉到顺铂和特定DNA序列的相互作用。因此,我们首次提出用体外筛选SELEX技术筛选与顺铂选择性特异结合的DNA序列,以期对顺铂的作用机理有所扩展和补充。根据实验方案构建了两个起始DNA随机库,分别探讨:一,GG两边的序列对形成Pt-GG加合物有无选择性的影响;二,G含量较低或不含GG的DNA序列能否与顺铂选择性的结合。两个随机库在第一轮筛选中就已得到与顺铂有一定识别能力的DNA序列,说明确有特异性结合顺铂的DNA序列存在。本研究为加深对顺铂抗癌机理的理解,以及今后新型铂类抗癌药物的设计提供理论指导。