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背景/目的肾小管细胞构成肾脏的大部分结构,维持正常的肾脏功能。肾小管细胞暴露于刺激时表现出各种退行性变化或者急性可逆或不可逆损伤。肾小管损伤和修复过程在上皮-间质转分化(EMT),肾纤维化,急性肾损伤(AKI)-慢性肾脏病(CKD)转变和CKD进展中起关键作用。肾功能下降的程度与肾小管间质损伤的程度密切相关。因此,保护肾小管上皮细胞结构和功能的完整性是减缓肾病进展的有效疗法。然而,目前干预和保护肾小管细胞的手段十分有限。在保护肾小管方面,中草药一直被认为是一种成本低廉而有效的药物。黄蜀葵花制剂长久以来被用于治疗肾病蛋白尿,并且黄葵胶囊已经获批为我国治疗慢性肾小球肾炎的III类新药。我们在临床中运用黄蜀葵花类药物治疗肾病蛋白积累了一些临床经验,并且在团队前期研究中发现黄蜀葵花提取物可以降低大鼠蛋白尿,抑制P38信号通路激活,减轻肾小球病理损伤。早期的研究主要聚焦于黄蜀葵花在足细胞中的保护作用,然而黄蜀葵花是否能保护肾小管上皮细胞尚不清楚。本研究拟构建NRK-52E细胞阿霉素损伤模型、阿霉素肾病大鼠模型,探讨阿霉素对肾小管上皮细胞损伤的分子机制以及黄蜀葵花对肾小管的保护作用及机理。方法细胞实验:①不同浓度阿霉素(O、0.5、1、1.5μg/mL)刺激NRK-52E细胞24h,CCK8检测细胞活力,观察光镜下形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡比例;②采用阿霉素(1μg/mL)构建肾小管上皮细胞凋亡模型,联合或不联合黄蜀葵花提取物(TEA)干预24h,观察镜下细胞形态变化,CCK8检测细胞活性,流式细胞术FITC/PI染色、TUNEL凋亡染色评估细胞凋亡比例。③活性氧/超氧化物探针检测阿霉素孵育0、1、2、4小时细胞内活性氧生成水平;阿霉素造模后联合或不联合黄蜀葵花、联合或不联合NAC观察细胞活性氧水平。Western blot检测MAPK信号通路P38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平、CCK8检测各组细胞活性。④Western blot检测阿霉素0、1、3、6、9小时造模后细胞ERK、P38磷酸化水平。Western blot检测TEA、NAC对P38及ERK、JNK磷酸化水平的影响。⑤Western blot检测阿霉素0、1、3、6、9小时造模后细胞ERK磷酸化水平及NLRP3表达的影响,Western blot检测TEA及NAC对NLRP3表达的影响。CCK8检测阿霉素联合或不联合TEA、ERK抑制剂U0126干预细胞24小时细胞活性。应用siRNA瞬时转染构建NLRP3敲减NRK-52E细胞株,Western blot检测阿霉素干预细胞后NLRP3及其调控的下游蛋白caspase-1、IL-1β活化情况以及细胞活性。动物实验:①阿霉素2次注射(剂量分别为4mg/kg、2mg/kg)+单侧肾切除术构建阿霉素肾病大鼠改良模型,予黄蜀葵花制剂-甲花片混悬液(1.5g/kg/d)进行干预,设置阴性对照组(生理盐水2mL),第28天处死并采集血样本、尿样本、肾脏。HE染色观察大鼠肾小管结构,Masson染色观察纤维胶原沉积,免疫组化观察大鼠肾组织NLRP3及下游效应分子caspase-1及IL-1β表达。②采用试剂盒检测大鼠血清肌酐、24小时尿蛋白、血白蛋白,比较各组间差异。结果细胞实验:①不同浓度阿霉素(0、0.5、1、1.5μg/mL)刺激NRK-52E细胞24h,CCK8检测见细胞活力逐渐下降。光镜下可见细胞数量减少,细胞排列疏松,失去铺路石样外观。流式细胞术示随着阿霉素剂量增高,细胞凋亡比例逐渐上升。②阿霉素(1μg/mL)联合黄蜀葵花提取物(TEA)(100μg/mL)干预24h,光镜下可见TEA缓解阿霉素诱导的细胞数量下降,ADR+TEA组细胞活性较ADR组提高,流式细胞术FITC/PI染色、TUNEL凋亡染色均提示TEA可以保护肾小管上皮细胞。③观察阿霉素孵育0、1、2、4小时细胞内活性氧/超氧化物逐渐递增。NRK-52E细胞阿霉素造模联合TEA可以减轻活性氧水平。联合NAC可见细胞活性氧水平明显下降、氧化蛋白表达降低。NAC可以减少阿霉素诱导的细胞凋亡。提示阿霉素通过激活ROS诱导细胞损伤。Western blot提示MAPK信号通路P38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平增高,但与NAC类似,TEA仅作用于抑制ERK磷酸化。④阿霉素0、1、3、6、9小时造模后Western blot可见细胞ERK磷酸化水平及NLRP3表达逐渐上升。并且ERK磷酸化时间(1小时)早于NLRP3激活(6小时)。⑤细胞活性检测提示TEA、ERK抑制剂U0126均可减少阿霉素诱导的细胞凋亡数量。提示TEA可能通过抑制ERK磷酸化保护细胞。NLRP3敲减可以保护阿霉素损伤的肾小管上皮细胞。TEA及ERK抑制剂U0126、NLRP3抑制剂INF39可以抑制阿霉素诱导的NLRP3及其调控的下游蛋白caspase-1、IL-1β表达下降。Tunel染色及细胞活性检测提示U0126、INF39的细胞保护作用。以上结果提示阿霉素通过ERK1/2-NLRP3炎症小体活化造成细胞损伤,而TEA通过抑制NLRP3及其上游ERK磷酸化保护肾小管上皮细胞。动物实验:①阿霉素造模28天后取材,HE染色可见阿霉素组(ADR)肾小管上皮细胞脱落,部分可见裸膜,部分可见再生。可见蛋白管型,肾小管上皮细胞颗粒样变性。阿霉素+甲花片组(ADR+TEA)可见肾小管上皮细胞脱落,较模型组缓解。Masson染色可见毛细血管袢和包曼氏囊节段黏连。肾小管上皮细胞脱落,可见裸膜,间质未见明显纤维化。阿霉素+甲花片组(ADR+TEA)肾小管损伤较阿霉素组明显减轻。免疫组化提示阿霉素诱导肾小管上皮细胞NLRP3蛋白表达增加,而甲花片可以降低NLRP3、caspase-1蛋白和IL-1β蛋白表达。②经注射阿霉素+左侧肾切除术后,大鼠蛋白尿增加,而甲花片混悬液灌胃可显著降低蛋白尿。阿霉素大鼠血清白蛋白显著降低,而甲花片缓解大鼠的低蛋白血症。但阿霉素注射后血清肌酐水平变化无统计学意义。结论:①阿霉素能够诱导肾小管上皮细胞的凋亡;②阿霉素可以诱导肾小管上皮细胞ERK1/2-NLRP3炎症小体的活化;③黄蜀葵花总提物(TEA)可能通过抑制ERK1/2介导的NLRP3炎症小体保护肾小管上皮细胞;④黄蜀葵花制剂(甲花片)对阿霉素肾病模型大鼠肾小管保护作用可能是通过抑制NLRP3炎症小体实现的。