活细胞内单分子研究的内容是要在活体情况下对单个生物大分子的动态及动力学过程做定量研究。迄今为止，大量的研究结果表明，通过对单个原子、单个分子的成像和操纵，已经能在单分子水平上研究生化反应的动力学过程和机制，并发现集团平均研究掩盖下的分子个体性质和行为的不均一性。单粒子追踪(Single Particle Tracking，SPT)技术基于先进的光学显微术和荧光标记方法，通过分析单分子、单粒子在细胞内的运动扩散信息，来研究蛋白质功能和相互作用及细胞膜的微观结构域。　　 本论文分两部分，第一部分为全内反射荧光成像技术中单粒子追踪技术的研究，首先测量了全内反射荧光成像和CCD图像采集系统的探测效率，建立了探测光子数和CCD的count数之间的对应关系，然后利用全内反射荧光成像系统进行溶液中单个纳米荧光小球的单粒子追踪研究，以此为基础，进行了活细胞内单分子的探测。第二部分为FRET荧光光谱技术，首先介绍了FRET扫描荧光光谱的实验方法，并利用FRET荧光光谱研究了Dok1蛋白分子间的相互作用。　　 本论文的创新点在于：　　 1.在实验室自建的物镜型全内反射荧光成像系统的基础上，对成像系统的分辨率，系统的探测效率进行了实验测量，并确定了被探测的光子数和CCD的count数之间的数量对应关系，为后续的实验数据分析提供了理论依据。对系统标定的结果显示：系统最高分辨率为200nm；最高时间分辨率为ms量级；在绿光波段的荧光信号探测效率可达4％；系统探测灵敏度可达～200个光子。　　 2.基于全内反射荧光成像及CCD图像采集系统，模拟了纳米荧光小球在活细胞胞浆液体环境中的运动，进行了甘油-水混合溶液(η=47cPoise)中单个纳米荧光小球(40nm)的单粒子追踪研究，纳米荧光小球的平均扩散系数D=0.4μm2·/s，根据Stokes—Einstein方程r=kBT/6πηD推算纳米小球的半径r=11±1nm。误差是由±1℃及甘油-水混合溶液的浓度±1％确定的。虽然推算的结果略小于纳米小球半径的实际值，但是数量级还是相当的。　　 3.首次实现了CHO活细胞内单个EGFR蛋白分子的动力学观测，为进一步研究EGFR在细胞膜表面的扩散行为，揭示其二聚化机制打下了基础。　　 4.建立了一套FRET荧光光谱测量装置，并首次对胞浆中的与酪氨酸激酶相关的一种信号分子Dok1的信号转导过程进行了FRET检测，实验结果显示，Dok1分子间的FRET表观效率Eα=8.9％，从而说明了Dok1分子间确实存在寡聚化相互作用。