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猪传染性胸膜肺炎(Porcinepleuropneumonia)是一种高度传染性、致死性的呼吸道疾病，该病的病原是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)。App的致病力由多种毒力因子决定，其溶血外毒素(Apx)被认为是最重要的毒力因子和保护抗原，其中ApxI又是四种Apx毒素中毒力最强的，ApxI毒素的结构蛋白apxIA有很好的反应原性和免疫原性，经表达纯化的apxIA蛋白可用于制备App亚单位疫苗；并可作为多种血清学诊断的抗原，对App强毒株感染作出诊断，以及评价apxIA亚单位疫苗免疫后的抗体水平。本研究以apxIA蛋白为主要研究对象，探索了App的最适培养条件：应用分子生物学手段，克隆并表达、纯化了apxIA可溶蛋白；利用该蛋白作为包被抗原，初步建立App间接ELISA的诊断方法，并测定了apxIA纯化蛋白免疫兔的体内抗体动态。
主要方法和结果如下：
1．App-259的培养、鉴定
本研究通过建立各种实验指标成功培养并鉴定了App-259参考菌株。结果表明：App-259符合App的生化和生物学特性；液体培养时，在添加0．02％NAD的基础上，适量添加酵母浸出液、蛋白胨、葡萄糖、绵羊裂解血和小牛血清等成分，在振荡条件下培养30h可使细菌达到最高浓度。
2．apxIA基因的序列分析
以App-259株为实验菌株，参考文献报道，设计合成特异的带特定酶切位点的引物，以提取的App基因组DNA为模板，用PCR的方法成功扩增出apxIA全基因，并进行序列测定。结果表明：所测的apxIA全基因核苷酸序列长3069bp，与Genbank数据库公布的参考序列(编号AF363361、AF240779、APU04954、D16582、X68595、X73¨7)的核苷酸同源性为95．5％～100％，相应的氨基酸同源性也为95．5％～100％。
3．apxIA基因的克隆、表达和蛋白纯化
纯化的PCR产物经克隆位点双酶切后与经同样位点双酶切的原核融合表达载体pMAL-c2X连接，将连接产物转化至克隆菌株E．coliDH5a，构建重组表达质粒apxIA-c2X：抽提apxIA-c2X质粒，转化至表达菌株E．coliTBl，构建表达重组菌apxIA-c2X-TBl，经鉴定后将其在IPTG诱导下表达，并通过Amylose树脂亲合柱纯化目的蛋白。结果表明：成功构建了apxIA-c2X质粒，并获得了apxlA-c2X-TBl表达重组菌；SDS-PAGE和Western-Blot分析表明，该重组菌在含100~g／mLAmp的LB培养液中，在15℃经0．2mmol／LIPTG诱导16小时，目的蛋白能获得高效表达(约占菌体总蛋白的40％)，目的蛋白大小为140～150KDa，表达产物是融合蛋白，去除融合的42．5KDaMBP融合蛋白，apxIA蛋白大小约为110KDa，与理论计算值相符；表达的目的蛋白约50％可溶，可溶蛋白经Amylose树脂亲合柱纯化可达到95％以上的纯度，不可溶部分也可用6mol／L的尿素进行初步纯化。
4．apxlA间接ELISA方法的建立
将apxIA蛋白作为包被抗原，初步建立间接ELISA方法。结果表明：在包被蛋白量为0．953gg／mL、血清稀释度为1：40、二抗稀释度为1：2000的条件下，选用5％脱脂奶粉进行封闭，能取得较好的ELISA实验结果。
5．apxlA蛋白抗兔血清的制备
成功制备了apxlA蛋白的免疫兔血清，并用本实验所建立的ELISA检测方法测定了apxlA蛋白免疫兔的抗体动态变化。结果表明，免疫后6周兔血清有较高的apxlA抗体效价。