类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎反复发作,导致关节内软骨和软骨下骨组织的破坏,关节功能障碍,最终造成关节畸形和强直。RA是最常见的风湿性疾病之一。不同RA患者的发病、病程及预后差异较大,严重者伴有多种并发症,且病变持续恶化。因此,RA的早期诊断和积极治疗尤为关键。RA的详细发病机制仍未阐明。一般认为是某种未知抗原作用于有遗传倾向的个体,诱导自身免疫应答,引发滑膜增生性病变,导致关节的破坏。自身免疫应答包括抗原递呈、免疫细胞相互作用和免疫效应三个阶段,是一个由多种免疫细胞(抗原递呈细胞、T细胞、B细胞)、分子(膜分子和可溶性分子)以及生物因子(细胞因子、炎性因子)参与并受到严格调控及制约的复杂生理过程。越来越多的实验证明,细胞因子参与RA的整个病理过程,并在其中发挥重要作用。各种生物因子间的关系密切、作用复杂,其特点是网络性和多相性。在RA不同的病理过程中参与的生物因子不同。IFN-γ、GM-CSF等在RA的触发阶段起关键作用;T细胞向滑膜迁移受IL-15、IL-16的调控;IL-4、IL-10则作用于B细胞的激活和分化生长。而IL-1、IL-8和TNF-α等炎症因子在病变中起主导作用。为进一步探讨细胞因子在RA中的免疫效应机制,本文第一部分建立细胞因子实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)检测方法。将分离获得的人外周血PBMC置激发型CD3抗体包被的培养板中培养,收取不同培养时间点的培养上清和单个核细胞。分离获得单个核细胞的总RNA并逆转录成cDNA。特异性扩增IL-2、IFN-γ和IL-10的基因片段,与PMD18-T载体连接,制备重组质粒并定量。在优化的PCR条件下,建立目的基因和内参照基因(β-Actin)的检测标准曲线,并检测单个核细胞中目的基因的mRNA表达。同时检测培养上清中相应细胞因子的含量,研究其相关性。结果显示:1.在优化的PCR条件下,目的基因和内参照基因的检测标准曲线稳定可靠,在106、105、104和103 copies/ml浓度范围内具有良好线性关系;2.受CD3抗体的激发,外周血单个核细胞胞浆目的基因的mRNA和相应的培养上清中蛋白质表达水平明显高于健康对照;3.目的基因的mRNA水平和蛋白质表达有一定的相关性。第二部分通过对活动期和缓解期RA患者外周血中CD4+T细胞表面的共刺激分子和凋亡分子、多种细胞因子及其相应的mRNA表达水平的检测,进而探讨这些免疫效应分子与类风湿性关节炎病程发展、转归以及预后的相关性。结果显示:1.急性活动期RA患者外周血CD4+T细胞表面CD154、CD69的表达明显高于健康对照组和RA稳定期组,而健康对照组和RA稳定期组之间无显著差异;2.急性活动期RA患者的血清和血浆sCD154水平均高于健康对照组和稳定期RA患者组;3.不同细胞因子在健康对照组血清中的基准水平不同,同样外周血PBMC中其相应的mRNA基准水平也有显著差异,细胞因子血清蛋白质基准水平与其mRNA基准水平完全不相关;4.急性活动期RA患者IL-6、IFN-γ以及IL-10的血清含量与其外周血PBMC中其相应的mRNA水平显著升高,两者之间有良好的相关性。综上所述,本研建究立了细胞因子荧光定量PCR的检测方法。采用该检测技术,分析急性活动期RA患者外周血细胞因子及其mRNA的表达变化,证实细胞因子在基因转录水平和蛋白质表达水平之间的相关性。RA患者细胞因子及其mRNA的检测,能为RA的临床诊断、治疗和愈后提供新的实验指标,具有潜在的应用价值。