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前言肌腱病(Tendinopathy)是一种常见的多种因素引起的肌腱功能障碍的综合征,其治疗方式多样,但总体治疗效果有限,究其原因在于肌腱病的发病机制尚未完全阐明[1-3]。肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)作为肌腱来源的特殊干细胞在维持肌腱正常生理功能及肌腱病病理生理过程中都扮演重要角色[4,5]。如何调控TSCs正常分化为肌腱细胞修复肌腱微损伤,对于提高肌腱病的防治水平具有重要意义。目前已研究证实TSCs可受多种因素调控,如机械应力[6-11]、炎症因子[11-15]、皮质醇激素[16]、细胞因子[14,17-21]等。在众多调控因素中,机械应力是肌腱病发病始动因素,对于TSCs调控作用重要性不言而喻。力生长因子(Mechano growth factor,MGF),也称为机械生长因子,广泛存在于骨、骨骼肌、肌腱、脑等组织[22-25],是在受到机械应力、电刺激或者组织损伤时产生的一种胰岛素样生长因子-1的选择性剪接异构体[24-27]。自从MGF被发现以来,其独特的E肽结构及其特有的功能吸引着众多学者的关注,现已证实MGF对多种细胞的增殖、迁移及分化有重要作用[28-36]。另外有研究发现肌腱组织经机械应力刺激后,MGF表达会显著升高,且反应时间明显早于IGF-1[37-41]。然而,TSCs作为肌腱病发病过程中的“明星细胞”,在受到机械牵伸应力作用后MGF表达水平如何变化以及MGF对其增殖分化及迁移能力是否起到一定的调节作用却未见相关报道。同时,机械牵伸和MGF对于TSCs的分化调控是单独作用还是共同作用?是相互协同作用还是拮抗作用呢?这一系列问题均亟待解决。因此,本课题研究目的主要是:1.验证机械牵伸对TSCs分化的调控及对MGF表达的影响;2.明确MGF对TSCs增殖、分化、迁移的影响及调控机制;3.阐明MGF在机械牵伸条件下对TSCs分化调控的影响及其机制。方法第一部分:进行大鼠TSCs分离培养鉴定;通过Real-time PCR、Western Blot分别从转录和翻译水平检测不同机械牵伸条件处理后TSCs中成骨、成脂及成肌腱分化的相关基因mRNA及蛋白表达水平,同时检测TSCs中MGF mRNA表达水平。第二部分:通过CCK8及实时无标记动态细胞分析技术检测TSCs经不同浓度MGF处理后,细胞增殖变化情况;通过Transwell、划痕试验及激光共聚焦显微镜检测不同浓度MGF处理对TSCs迁移能力及细胞骨架变化的影响;通过Western Blot检测TSCs经不同浓度MGF及MAPK/ERK通路抑制剂PD98059处理后,成腱分化相关基因蛋白表达变化。第三部分:通过Real-time PCR和Western Blot分别检测机械牵伸与MGF共同处理TSCs后,成肌腱、成骨及成脂三系分化相关基因mRNA及蛋白相对表达变化。结果第一部分:1.4%1Hz组牵伸48h成腱分化指标TNC和成骨分化指标RUNX2相对表达量较静态培养组均显著升高(P<0.05);4%2Hz组各牵伸时间点TNC相对表达量较静态培养组均明显升高(P<0.05),同时牵拉24h时CEBPα表达受到显著抑制(P<0.05),RUNX2相对表达量较对照组无明显差异(P>0.05);8%1Hz组牵拉24h RUNX2表达水平显著高于静态培养组(P<0.05),同时成肌腱分化及成脂肪分化相关基因表达较静态培养组无显著变化(P>0.05);8%2Hz组牵拉48h时CEBPα表达水平显著高于静态培养组(P<0.05),同时RUNX2相对表达量较静态培养组无显著差异(P>0.05),TNC相对表达量较静态培养组显著降低(P<0.05)。2.不同条件机械牵伸会引起TSCs中MGF mRNA相对表达量出现不同水平的增加。4%2Hz及8%1Hz组牵伸12小时即可见MGF mRNA水平显著升高(P<0.05),牵伸24h时MGF mRNA表达量达到顶峰,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:1.CCK-8结果显示:TSCs经5ng/ml MGF处理后,24小时开始OD值即出现显著升高,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05),但其余各组间吸光度无明显差异(P>0.05)。RTCA结果显示:经1ng/ml及5ng/ml MGF处理后,TSCs细胞指数较其余各组均升高,差异有统计学意义(P<0.05),但两组间无显著性差异(P>0.05);经10ng/ml、25ng/ml和50ng/ml MGF及5ng/ml MGF+10μg/ml PQ401处理后,细胞指数较对照组显著降低(P<0.05);5ng/mlMGF+50μM PD98059组较其余各组,细胞指数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.划痕实验结果显示:经1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml MGF处理后,TSCs迁移能力较对照组均明显加快,其中5ng/ml MGF处理组TSCs的迁移速度最快。Transwell结果显示:TSCs经过不同浓度MGF处理后,TSCs迁移数量均有显著增加,OD值显著升高(P<0.05),其中以5ng/ml和7.5ng/ml组最为明显;另外5ng/ml MGF+50μM PD98059组与5ng/ml MGF组相比,TSCs迁移数量明显减少,OD值显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);而5ng/ml MGF+10μg/ml PQ401组细胞形态发生明显改变,细胞迁移数量最少,OD值最低。激光共聚焦显微镜观察可见:经0、1.0、2.5、5.0、7.5及10.0ng/ml MGF处理的TSCs,细胞骨架连续性良好,荧光强,细胞成典型长梭形,肌动蛋白纤维排列规则;经高浓度(25ng/ml及50ng/ml)MGF处理后,TSCs形态成不规则形,细胞骨架断裂,排列紊乱,荧光强度变弱;经10μg/ml PQ401处理后,TSCs细胞形态出现明显改变,细胞骨架断裂,呈颗粒样,荧光强度极弱。3.Western Blot结果显示TSCs经5ng/ml及10ng/mlMGF处理72h后,TNC、SCX蛋白表达量均较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而经1ng/ml及25ng/ml MGF处理后,蛋白表达较对照组无明显差异(P>0.05)。第三部分:1.Real-time PCR结果显示:TSCs经0ng/ml、2.5ng/ml以及5.0ng/ml MGF处理后,在4%2Hz机械牵伸条件下牵伸24h,SCX和TNC mRNA相对表达较静态培养组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。RUNX2、DLX5以及AP2、PPARγmRNA相对表达量较静态培养组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。50μM PD98059+5ng/ml MGF组TSCs经4%2Hz机械牵伸24h后,全部基因的mRNA相对表达量较未添加抑制剂的5ng/ml MGF组变化倍数显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.Western blot结果显示:TSCs经0、2、5ng/ml MGF处理后,在4%2Hz机械牵伸下牵拉24h,TNC蛋白相对表达量较静态培养组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。RUNX2以及CEBPα蛋白相对表达量较静态培养组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。50μM PD98059+5ng/ml MGF组TSCs经4%2Hz机械牵伸24h后,全部分化相关基因的蛋白相对表达量较未添加抑制剂的5.0ng/mlMGF组变化倍数显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论第一部分:不同条件的机械牵伸会引起TSCs向不同方向分化。4%2Hz 24h为诱导成肌腱分化的最佳牵伸条件,8%1Hz 24h为诱导成骨分化的最佳牵伸条件,8%2Hz 48h为诱导成脂肪分化的最佳牵伸条件。机械牵伸可上调TSCs中MGF表达水平,且与成肌腱分化相关。第二部分:MGF可增强TSCs迁移及增殖能力,并且可诱导TSCs向肌腱细胞方向分化,其中对增殖和迁移促进作用与MAPK/ERK通路激活相关。第三部分:机械牵伸与MGF协同促进TSCs向肌腱方向分化,抑制成脂及成骨分化。机械牵伸条件下MGF对TSCs分化的诱导调控是通过激活MAPK/ERK通路发挥作用。