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中国卤虫(Artemia sinica)在胚胎发育过程中,外界环境的变化能够导致中国卤虫胚胎产生滞育现象。在胚胎滞育和重启动过程中,胚胎一方面需要修复其DNA损伤,另一方面需要调节细胞周期以调控胚胎的再启动过程。当外源或内源DNA损伤因子攻击细胞时,细胞周期检查点相关蛋白RAD9(Cell cycle checkpoint control protein RAD9A)可参与细胞周期的阻滞延缓,同时,待细胞中受损DNA得到完善修复后再恢复细胞周期正常运转,以确保滞育胚胎能够正常发育。RAD9还参与调节下游靶基因的转录、影响核苷酸合成、诱导细胞凋亡和胚胎发育等细胞活动。目前,RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动中的作用一直没有研究,因此,本研究对进一步分析中国卤虫胚胎滞育和滞育解除过程中RAD9对细胞周期的调控作用具有较为重要的理论意义。本文首次克隆了中国卤虫As-rad9基因cDNA全长,并对其进行了生物信息学分析,采用实时定量PCR方法检测As-rad9基因在中国卤虫胚胎发育各时期,温度胁迫及盐度胁迫条件下mRNA的表达水平及表达模式,利用免疫印迹技术检测RAD9及其相关蛋白RAD17,HUS1,RAD1,CHK1和CDC25A在卤虫胚胎发育过程中蛋白表达模式及表达水平,利用小RNA干扰(small interfering RNA,siRNA)技术确定RAD9在卤虫早期胚胎发育过程中的作用。结果显示,As-rad9基因全长1238 bp,编码出377个氨基酸,蛋白的分子量约是42.6 kDa,等电点约是6.48,是一个亲水蛋白,通过亚细胞定位发现其最可能定位在细胞核中。荧光实时定量PCR结果显示,As-rad9基因在胚胎发育5小时阶段呈现最高表达水平,随后逐渐降低,至40小时后呈现逐渐上升趋势;Western blot结果显示,RAD9蛋白的表达趋势和mRNA表达趋势大体一致,还发现As-RAD9,As-RAD1,As-RAD17,As-CHK1和As-CDC25A的蛋白表达水平与其在不同胚胎阶段的表达水平一致。结果表明As-RAD9是一种应激相关因子,可促进或抑制细胞周期检查点相关基因在滞育胚胎重启过程中的表达。通过免疫荧光实验可以看出RAD9在中国卤虫的每个阶段均有表达,无组织器官特异性,大多定位在细胞核中。通过小RNA干扰实验证明敲除As-rad9基因会增大卤虫的死亡率,并延缓卤虫胚胎发育。该研究分析了RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中的表达模式、表达部位及与其他相关蛋白的调控关系,证明RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中发挥了重要作用。这些研究结果对进一步深入了解卤虫滞育及解除的分子机制提供了参考资料。