目的： 本课题旨在利用RNA干扰技术结合高分子纳米材料研究的最新成果，通过特异性下调人Tenon's囊成纤维细胞中IKKB基因的表达，进而调节细胞内NF-κB的活性，达到调控细胞因子和生长因子的分泌，控制成纤维细胞的增殖、移行、分泌及表型转化能力，从而平衡调控青光眼滤过手术后滤过道局部创口愈合过程的目的；探讨采用生物调节方式平衡调控青光眼滤过手术后功能性滤过道形成与局部创口愈合过程的可行性、有效性及其具体的作用机制，为最终实现青光眼滤过性手术成功率的提高提供科学的实验依据。 方法： 1.人Tenon's囊成纤维细胞的体外培养及鉴定：取角膜移植供体眼球的Tenon's囊组织，采用组织块培养法体外培养成纤维细胞；免疫细胞化学法鉴定所培养的细胞是否表达成纤维细胞的特征型抗原；透射电镜下观察所培养细胞的超微结构。 2.RNA干扰转染用新型纳米微载体的合成与筛选：设计并人工合成用于转染小干扰RNA进入人Tenon's囊成纤维细胞的阳离子纳米聚合物CS-g-(PEI600-g-PEG)及CS-g-(PEI1800-g-PEG)，利用ZetasizerNano动态光散射仪测量其与siRNA结合后形成的纳米微球的粒径；电泳迁移法检测其结合siRNA的能力；流式细胞仪和荧光显微镜检测其转染siRNA的效率：MTT法检测其细胞毒性。通过以上检测指标筛选出与siRNA结合能力较强、转染效率较高、细胞毒性较小的纳米材料作为siRNA转染人Tenon's囊成纤维细胞的微载体。 3.筛选靶向IKKB基因的高效siRNA：设计并人工合成靶向IKKB基因的siRNAs三对，以100nM的相同浓度在新型纳米微载体的介导下转染人Tenon's囊成纤维细胞，利用RT-PCR技术检测IKKB的mRNA表达水平，筛选出具有较高RNA干扰效率的siRNA。 4.IKKB-siRNA转染人Tenon's囊成纤维细胞后RNA干扰效应的检测：将IKKB-siRNA以不同浓度(5nM，10nM，25nM，50nM，100nM)转染人Tenon's囊成纤维细胞，用realtimeRT-PCR法检测RNA干扰24小时后IKKB的mRNA表达水平；用Westernblot法检测RNA干扰72小时后IKKB的蛋白表达水平；免疫细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测RNA干扰72小时后NF-κB活性的变化。 5.IKKB-siRNA调控人Tenon's囊成纤维细胞增殖的检测以及与丝裂霉素抗增殖作用的比较：将IKKB-siRNA以不同浓度(5nM，10nM，25nM，50nM，100nM)转染人Tenon's囊成纤维细胞，同时设不同浓度(0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.8mg/ml)的丝裂霉素处理组，用CellTiter96()细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖程度的改变，分别绘制量效曲线；倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化；透射电子显微镜下观察并比较RNA干扰组和丝裂霉素处理组细胞超微结构的变化。 6.靶向IKKB基因的RNA干扰对人Tenon's囊成纤维细胞生物学行为影响的分析：IKKB-siRNA转染人Tenon's囊成纤维细胞后，利用流式细胞仪检测处于不同细胞周期亚群的比例；免疫细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测RNA干扰后细胞α-SMA的表达变化，以及collagenI分泌的改变；划痕法检测细胞迁移能力的变化。 结果： 1.成功进行了人Tenon's囊成纤维细胞的体外培养，观察到传代3-6代的细胞形态呈长梭形，核较大，胞浆丰富，呈漩涡状排列生长，增殖能力强。免疫细胞化学检测呈Vimentin、Fibronectin染色阳性。 2.通过对人工合成的两种纳米材料进行siRNA结合能力、转染效率及细胞毒性的测试，筛选出其中一种具有较强的siRNA结合能力、较高的转染效率及较小的细胞毒性，化学成分为CS-g-(PEI600-g-PEG)的纳米材料作为转染siRNA进入人Tenon's囊成纤维细胞的微载体。 3.设计合成的三对siRNAs转染人Tenon's囊成纤维细胞24小时后，经RT-PCR法检测发现其中一对siRNA对IKKB的mRNA表达抑制程度最高。 4.以不同浓度的IKKB-siRNA转染人Tenon's囊成纤维细胞后，realtimeRT-PCR法检测发现RNA干扰24小时后IKKB的mRNA表达水平随siRNA浓度的增加而降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；Westernblot法检测发现RNA干扰72小时后IKKB的蛋白表达水平亦随siRNA浓度的增加而降低。 5.激光共聚焦显微镜检测发现靶向IKKB基因的RNA干扰后NF-κB的活化受到了抑制，活化并进入细胞核内的NF-κB显著减少。 6.CellTiter96()细胞增殖检测试剂盒检测发现以不同浓度的IKKB-siRNA转染人Tenon's囊成纤维细胞后，细胞的增殖程度随siRNA浓度的增加而降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；透射电子显微镜观察发现，达到最高抑制率时RNA干扰不会造成丝裂霉素处理组所见的细胞坏死或凋亡。 7.IKKB-siRNA转染人Tenon's囊成纤维细胞后，流式细胞仪检测发现处于G0/G1期的细胞亚群比例增加，而处于G2/M期的细胞亚群比例降低；激光共聚焦显微镜观察发现RNA干扰后细胞胞浆中α-SMA的表达减少，collagenI的分泌减少；划痕法检测显示细胞迁移能力降低。 结论： 1.人工合成的阳离子聚合物CS-g-(PEI600-g-PEG)，具有siRNA结合能力强、转染效率高、细胞毒性小的特点，可以作为转染siRNA进入人Tenon's囊成纤维细胞的微载体。 2.通过靶向IKKB基因的RNA干扰，可以高效抑制核转录因子κB抑制蛋白激酶β(即IKKB)的表达，进而调控NF-κB的活性，减少活化并进入细胞核的NF-κB的数量。 3.通过靶向IKKB基因的RNA干扰，能够抑制体外培养的人Tenon's囊成纤维细胞的增殖，且抑制的程度随转染siRNA浓度的增加而加大，达到最高抑制率的同时，未对细胞的正常结构造成影响。 4.通过靶向IKKB基因的RNA干扰，能够调控体外培养的人Tenon's囊成纤维细胞的多种生物学行为：包括减少进入有丝分裂G2/M期的细胞数量，减少表型向肌成纤维细胞转分化的细胞数量，降低细胞分泌胶原的能力以及迁移能力。