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禽类胚胎期骨骼肌细胞增殖、分化是肌肉发育关键阶段。胚胎期成肌细胞增殖和分化过程为肌肉次级发育阶段,肌纤维数量在此阶段已确定,出生后不再增减。因此,胚胎期肌纤维的生长发育决定出雏后骨骼肌的发育潜能。本文主要探究EBP1对鸡胚成肌细胞的增殖和分化过程的作用及调控机制。本研究通过分离九胚龄鸡骨骼肌成肌细胞纯化、培养,建立成肌细胞体外培养模型。采用免疫荧光染色检测EBP1在成肌细胞发育过程中的表达情况及肌管融合程度;利用荧光定量PCR对Ebp1基因内源性表达和参与成肌细胞发育相关基因的表达规律进行分析;采用流式分析和EdU标记法检测EBP1对成肌细胞增殖的影响;利用慢病毒shRNA技术构建Ebp1干扰模型,研究EBP1对生肌因子表达及成肌细胞分化的影响;并通过Western b1ot对相关蛋白和相关通路进行分析。主要的研究结果如下:1.EBP1在鸡胚成肌细胞中内源性表达情况。Ebp1基因随着胚龄的增加在骨骼肌中表达呈显著上调(P<0.05);并且Ebp1在体外培养的成肌细胞中均有表达,增殖期保持平稳表达,而分化期呈显著上升趋势(P<0.05);通过Western b1ot检测到EBP1蛋白在成肌细胞增殖分化过程中的表达均显著上升(P<0.05);另外,免疫荧光共染结果表明EBP1在成肌细胞存在较高的内源性表达。这些结果表明EBP1在胚胎期骨骼肌的发育过程中高表达,参与成肌细胞的生长发育过程。2.慢病毒介导Ebp1干扰模型的构建及最佳干扰位点筛选。构建干扰Ebp1基因表达的四个靶向位点,进行药物筛选提高干扰效率;通过荧光定量PCR检测四个干扰位点的干扰率分别为79.5%、83.6%、63.5%和17.6%,LV1、LV2两个位点干扰效率较高,与对照相比Ebp1基因表达量极显著下降(P<0.01),干扰效率达75%以上,干扰效果明显。3.EBP1对成肌细胞增殖的影响。干扰Ebp1表达后,通过实时定量PCR分析Cyclin D1和c-Myc基因的表达,与对照组相比均无显著差异(P>0.05);利用EdU标记法分析成肌细胞的增殖指数,与对照组相比无明显差异(P>0.05);另外,采用流式分析成肌细胞的周期,与对照组相比细胞周期变化也不显著(P>0.05)。以上结果表明EBP1不影响成肌细胞的增殖过程。4.EBP1对成肌细胞分化的影响。干扰Ebp1表达后,成肌细胞继续在分化培养基中培养2天,通过实时定量PCR分析参与成肌细胞生肌相关基因的表达水平。干扰Ebp1后第一天和第二天,与对照组相比,MRFs家族成员、Pax3和MyHC的表达均明显抑制(P<0.05),并且第二天MRFs被抑制作用更明显,而Pax7和Desmin则无差异性(P>0.05);同时蛋白免疫印迹分析结果显示与对照组相比,MYOD、MYOG、MyHC和PAX7蛋白的表达也受到显著抑制(P<0.01)。另外,MyHC免疫荧光染色分析成肌细胞融合指数,干扰Ebp1组与对照组相比,肌管融合明显减少(P<0.05)。结果揭示EBP1通过调节MRFs促进成肌细胞分化融合。5.SMAD2/3参与EBP1促进成肌细胞的分化过程。通过蛋白免疫印迹检测干扰EBP1表达后,磷酸化的SMAD2/3蛋白表达与对照组相比极显著上调(P<0.01);利用LY2109761抑制SMAD蛋白,检测MYOG和MYOD蛋白水平与对照相比均极显著下调(P<0.01)。说明EBP1能够抑制磷酸化SMAD2/3蛋白表达,上调MRFs促进成肌细胞分化。通过成肌细胞离体培养、诱导分化和慢病毒干扰等技术,研究发现EBP1能促进鸡胚原代培养成肌细胞的分化融合,但不影响其增殖过程。EBP1通过抑制磷酸化Smad2/3的表达,进而上调MRFs家族成员蛋白水平促进成肌细胞分化。本研究为了解EBP1调控成肌细胞发育的分子机制提供技术平台和理论基础。