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目的：
为探究2-DG是否能够在细胞和动物水平上抑制糖酵解从而影响RA-FLS的生物学行为、炎性因子分泌以及相关机制，本研究设计为两部分。第一部分是细胞实验，收集临床RA患者滑膜组织标本，培养RA-FLS。用2-DG处理RA-FLS，体外观察2-DG对RA-FLS的增殖、凋亡、迁移、细胞因子分泌等作用。第二部分是动物实验，通过牛Ⅱ胶原诱导大鼠，构建RA经典动物模型CIA大鼠，观察2-DG是否具有治疗作用，并通过检测糖酵解关键酶的表达、mTOR信号通路的相关分子、免疫细胞、细胞因子分泌水平以进一步探究2-DG的作用机制。
方法：
1.收集在山东大学附属千佛山医院接受膝关节置换手术的RA患者的滑膜标本10例，其中男性3例，女性7例，年龄区问39-80岁，平均年龄60岁，从滑膜组织中获取原代RA-FLS细胞并培养。
2.为研究2-DG对RA.FLS细胞增殖的影响，将RA-FLS细胞依次分为2-DG(1、10、20mM)处理组和对照组(等体积PBS)，培养12h、24h和48h，然后用CCK-8检测2-DG对细胞增殖能力的影响。
3.为研究2-DG对RA-FLS细胞凋亡、迁移和细胞因子分泌的影响，将RA-FLS细胞依次分为2-DG处理组(1、10、20mM)和对照组，并培养48h。采用流式细胞术检测细胞的凋亡和炎性细胞因子，采用划痕实验及Transweil实验检测细胞的迁移。观察2-DG对RA-FLS细胞功能的影响。
4.为研究2-DG对RA-FLS细胞糖酵解的影响，将RA-FLS细胞依次分为2-DG处理组(10、20mM)和对照组，并培养48h。采用Real-time PCR技术检测糖酵解相关酶基因己糖激酶2(Hexokinase2，HK2)、磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase，PFK)、磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase1，TPII)、磷酸甘油酸激酶l(Phosphoglycerate kinase1，PGKl)、烯醇化酶1(Enolase1，ENOI)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PKM)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的mRNA水平。采用Westem blot验证HK2的蛋白表达水平。采用ELISA法检测ATP含量。观察2-DG对RA-FLS细胞糖酵解的影响。
5.为研究2-DG对RA.FLS细胞mTOR信号通路的影响，将RA-FLS细胞依次分为对照组和2-DG处理组(10、20mM)，并培养48h。采用Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phos-phorylated mTOR，p-mTOR)、磷酸化起始因子4E结合蛋白1(Phos.phorylated elF4E-binding protein1，p-4EBPl)的蛋白水平。观察2-DG对RA-FLS细胞mTOR通路的影响。
6.为研究2-DG对CIA大鼠的治疗作用，建立CIA大鼠作为RA的动物模型(n=20)，并设立健康对照组(-Normal Control，NC，n=10)。随机选取CIA大鼠(n=10)，腹腔注射2-DG(5mg/kg)进行治疗，作为2-DG治疗组。绘制随时间变化的关节炎临床评分曲线，同时采用HE组织化学法、X-ray评估病理变化。观察2-DG能否治疗CIA关节炎。
7.为研究2-DG对CIA大鼠的糖酵解作用，采用Real-time PCR技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中糖酵解酶基因HK2、PFK、TPll、PGKl、ENOl、PKM、LDH的mRNA水平;采用Western blot检测分析NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中HK2蛋白;ELISA法检测滑膜组织中ATP含量的变化。观察2-DG对CIA大鼠体内糖酵解的影响。
8.为研究2-DG对CIA大鼠mTOR信号通路的影响，采用Western blot检测NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中mTOR、p-mTOR和p-4EBP1的蛋白水平，观察2-DG对CIA大鼠体内mTOR通路的影响。
9.为研究2-DG对CIA大鼠外周血免疫细胞的调节作用，采用流式细胞技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组中大鼠的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK(Natural killer cell)和Treg(Regulatory cell)细胞在外周血中的比例变化，观察2-DG治疗前后淋巴细胞亚型的变化。
10.为研究2-DG对CIA大鼠外周血细胞因子的影响，采用流式细胞技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组中大鼠的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α的血清水平变化，观察2-DG治疗前后细胞因子的变化。
结果：
1.CCK-8法检测2-DG对RA-FLS细胞增殖的影响。结果显示，相同时间段内，2-DG处理组(1、10、20mM)细胞增殖能力明显低于对照组(P＜0.001)。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞的增殖。
2.流式细胞术检测2-DG对RA-FLS细胞凋亡的影响。结果显示，2-DG(1、10、20mM)处理的三个实验组，细胞的凋亡率都明显高于对照组(P1mM=0.020，P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)。说明2-DG可以促进RA-FLS细胞的凋亡。
3.细胞迁移的功能由细胞划痕实验和Transwell实验共同验证。划痕实验结果显示，2-DG(1、10、20mM)处理组的伤口愈合情况均显著低于对照组(P1mM＜0.01，P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)。Transwell实验结果显示，1mM处理组无变化(P1mM=0.070)，10mM和20mM处理组的细胞迁移能力明显弱于对照组(P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)。以上结果说明2-DG抑制RA-FLS细胞的迁移。
4.流式细胞技术检测2-DG处理组(1、10、20mM)和对照组细胞培养上清液中细胞因子的变化水平。结果显示，与对照组相比，IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平无变化(PIL-2=0.71，PIL-4=0.22，PIL-10=0.17，PIFN-γ=0.78)，只有IL-6(P1mM＜0.05，P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)和TNF-α(P1mM=0.250，P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)水平显著低于对照组。说明2-DG抑制RA-FLS细胞中IL-6和TNF-α的分泌。
5.Real-time PCR检测2-DG对RA-FLS细胞中HK2、PFK、TPII、PGKl、ENOI、PKM、LDH的mRNA水平的影响。结果显示TPll、PGKl、ENOl和LDH各组间无差异(PTPll=0.676，PPGKl=0.679，PEN01=0.788，PLDH=0.272)。与对照组相比，2-DG处理组的HK2(P10mM=0.042，P20mM=0.011)、PFK(P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)、PKM(P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)的mRNA水平显著降低。用Western blot验证RA-FLA细胞中HK2的变化。结果显示，与对照组相比，2-DG处理组HK2的蛋白表达量显著降低(P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)，细胞内ATP的产量也随之降低(P10mM=0.019，P20mM＜0.001)。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞中的糖酵解水平。
6.Western blot检测2-DG(10、20mM)对RA—FLS细胞mTOR通路变化。与对照组相比，2-DG处理组中p-4EBPl的活化水平显著上调(P10M＜0.001，P20mM＜0.001)，mTOR(P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)和P-mToR(P10m M＜0.001，P20mM＜0.001)的表达明显受抑。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞中的mTOR信号通路。
7.通过腹腔注射2-DG(5mg/kg)治疗10次后，关节炎临床评分结果显示，CIA组的大鼠关节炎症状明显重于NC组(P＜0.001)。2-DG治疗组的大鼠关节炎症状较CIA组缓解(P=0.004)，但仍比NC组严重(P＜0.01)。白光拍摄图片表观显示，NC组的大鼠关节无炎症表现;CIA组的大鼠踝关节肿胀，局部皮肤发红;2-DG治疗组的大鼠关节肿胀缓解，局部皮肤未见其他变化。HE染色结果显示，NC组、2-DG治疗组关节腔干净。
结论：
上述结果发现2-DG能够抑制RA-FLS和CIA大鼠滑膜中的糖酵解。2-DG通过抑制HK2、PFK、PKM的表达水平抑制糖酵解过程，导致ATP产量下降。2-DG抑制RA-FLS和CIA大鼠滑膜中的mTOR信号通路，促进RA-FLS细胞的凋亡，抑制其增殖和迁移，降低RA-FLS和CIA大鼠IL-6和TNF-α分泌水平。2-DG还降低CIA大鼠中B、T及NK细胞比例并升高Treg细胞。我们的结果建议糖酵解HK2抑制剂2-DG可以通过抑制关节滑膜细胞活化、抑制其mTOR信号活化、降低炎性免疫细胞比例和炎性细胞因子水平、提升Treg细胞比例实现对RA的治疗效应。HK2是潜在的RA治疗靶点。
为探究2-DG是否能够在细胞和动物水平上抑制糖酵解从而影响RA-FLS的生物学行为、炎性因子分泌以及相关机制，本研究设计为两部分。第一部分是细胞实验，收集临床RA患者滑膜组织标本，培养RA-FLS。用2-DG处理RA-FLS，体外观察2-DG对RA-FLS的增殖、凋亡、迁移、细胞因子分泌等作用。第二部分是动物实验，通过牛Ⅱ胶原诱导大鼠，构建RA经典动物模型CIA大鼠，观察2-DG是否具有治疗作用，并通过检测糖酵解关键酶的表达、mTOR信号通路的相关分子、免疫细胞、细胞因子分泌水平以进一步探究2-DG的作用机制。
方法：
1.收集在山东大学附属千佛山医院接受膝关节置换手术的RA患者的滑膜标本10例，其中男性3例，女性7例，年龄区问39-80岁，平均年龄60岁，从滑膜组织中获取原代RA-FLS细胞并培养。
2.为研究2-DG对RA.FLS细胞增殖的影响，将RA-FLS细胞依次分为2-DG(1、10、20mM)处理组和对照组(等体积PBS)，培养12h、24h和48h，然后用CCK-8检测2-DG对细胞增殖能力的影响。
3.为研究2-DG对RA-FLS细胞凋亡、迁移和细胞因子分泌的影响，将RA-FLS细胞依次分为2-DG处理组(1、10、20mM)和对照组，并培养48h。采用流式细胞术检测细胞的凋亡和炎性细胞因子，采用划痕实验及Transweil实验检测细胞的迁移。观察2-DG对RA-FLS细胞功能的影响。
4.为研究2-DG对RA-FLS细胞糖酵解的影响，将RA-FLS细胞依次分为2-DG处理组(10、20mM)和对照组，并培养48h。采用Real-time PCR技术检测糖酵解相关酶基因己糖激酶2(Hexokinase2，HK2)、磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase，PFK)、磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase1，TPII)、磷酸甘油酸激酶l(Phosphoglycerate kinase1，PGKl)、烯醇化酶1(Enolase1，ENOI)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PKM)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的mRNA水平。采用Westem blot验证HK2的蛋白表达水平。采用ELISA法检测ATP含量。观察2-DG对RA-FLS细胞糖酵解的影响。
5.为研究2-DG对RA.FLS细胞mTOR信号通路的影响，将RA-FLS细胞依次分为对照组和2-DG处理组(10、20mM)，并培养48h。采用Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phos-phorylated mTOR，p-mTOR)、磷酸化起始因子4E结合蛋白1(Phos.phorylated elF4E-binding protein1，p-4EBPl)的蛋白水平。观察2-DG对RA-FLS细胞mTOR通路的影响。
6.为研究2-DG对CIA大鼠的治疗作用，建立CIA大鼠作为RA的动物模型(n=20)，并设立健康对照组(-Normal Control，NC，n=10)。随机选取CIA大鼠(n=10)，腹腔注射2-DG(5mg/kg)进行治疗，作为2-DG治疗组。绘制随时间变化的关节炎临床评分曲线，同时采用HE组织化学法、X-ray评估病理变化。观察2-DG能否治疗CIA关节炎。
7.为研究2-DG对CIA大鼠的糖酵解作用，采用Real-time PCR技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中糖酵解酶基因HK2、PFK、TPll、PGKl、ENOl、PKM、LDH的mRNA水平;采用Western blot检测分析NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中HK2蛋白;ELISA法检测滑膜组织中ATP含量的变化。观察2-DG对CIA大鼠体内糖酵解的影响。
8.为研究2-DG对CIA大鼠mTOR信号通路的影响，采用Western blot检测NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中mTOR、p-mTOR和p-4EBP1的蛋白水平，观察2-DG对CIA大鼠体内mTOR通路的影响。
9.为研究2-DG对CIA大鼠外周血免疫细胞的调节作用，采用流式细胞技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组中大鼠的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK(Natural killer cell)和Treg(Regulatory cell)细胞在外周血中的比例变化，观察2-DG治疗前后淋巴细胞亚型的变化。
10.为研究2-DG对CIA大鼠外周血细胞因子的影响，采用流式细胞技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组中大鼠的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α的血清水平变化，观察2-DG治疗前后细胞因子的变化。
结果：
1.CCK-8法检测2-DG对RA-FLS细胞增殖的影响。结果显示，相同时间段内，2-DG处理组(1、10、20mM)细胞增殖能力明显低于对照组(P＜0.001)。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞的增殖。
2.流式细胞术检测2-DG对RA-FLS细胞凋亡的影响。结果显示，2-DG(1、10、20mM)处理的三个实验组，细胞的凋亡率都明显高于对照组(P1mM=0.020，P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)。说明2-DG可以促进RA-FLS细胞的凋亡。
3.细胞迁移的功能由细胞划痕实验和Transwell实验共同验证。划痕实验结果显示，2-DG(1、10、20mM)处理组的伤口愈合情况均显著低于对照组(P1mM＜0.01，P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)。Transwell实验结果显示，1mM处理组无变化(P1mM=0.070)，10mM和20mM处理组的细胞迁移能力明显弱于对照组(P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)。以上结果说明2-DG抑制RA-FLS细胞的迁移。
4.流式细胞技术检测2-DG处理组(1、10、20mM)和对照组细胞培养上清液中细胞因子的变化水平。结果显示，与对照组相比，IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平无变化(PIL-2=0.71，PIL-4=0.22，PIL-10=0.17，PIFN-γ=0.78)，只有IL-6(P1mM＜0.05，P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)和TNF-α(P1mM=0.250，P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)水平显著低于对照组。说明2-DG抑制RA-FLS细胞中IL-6和TNF-α的分泌。
5.Real-time PCR检测2-DG对RA-FLS细胞中HK2、PFK、TPII、PGKl、ENOI、PKM、LDH的mRNA水平的影响。结果显示TPll、PGKl、ENOl和LDH各组间无差异(PTPll=0.676，PPGKl=0.679，PEN01=0.788，PLDH=0.272)。与对照组相比，2-DG处理组的HK2(P10mM=0.042，P20mM=0.011)、PFK(P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)、PKM(P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)的mRNA水平显著降低。用Western blot验证RA-FLA细胞中HK2的变化。结果显示，与对照组相比，2-DG处理组HK2的蛋白表达量显著降低(P10mM＜0.01，P20mM＜0.01)，细胞内ATP的产量也随之降低(P10mM=0.019，P20mM＜0.001)。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞中的糖酵解水平。
6.Western blot检测2-DG(10、20mM)对RA—FLS细胞mTOR通路变化。与对照组相比，2-DG处理组中p-4EBPl的活化水平显著上调(P10M＜0.001，P20mM＜0.001)，mTOR(P10mM＜0.001，P20mM＜0.001)和P-mToR(P10m M＜0.001，P20mM＜0.001)的表达明显受抑。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞中的mTOR信号通路。
7.通过腹腔注射2-DG(5mg/kg)治疗10次后，关节炎临床评分结果显示，CIA组的大鼠关节炎症状明显重于NC组(P＜0.001)。2-DG治疗组的大鼠关节炎症状较CIA组缓解(P=0.004)，但仍比NC组严重(P＜0.01)。白光拍摄图片表观显示，NC组的大鼠关节无炎症表现;CIA组的大鼠踝关节肿胀，局部皮肤发红;2-DG治疗组的大鼠关节肿胀缓解，局部皮肤未见其他变化。HE染色结果显示，NC组、2-DG治疗组关节腔干净。
结论：
上述结果发现2-DG能够抑制RA-FLS和CIA大鼠滑膜中的糖酵解。2-DG通过抑制HK2、PFK、PKM的表达水平抑制糖酵解过程，导致ATP产量下降。2-DG抑制RA-FLS和CIA大鼠滑膜中的mTOR信号通路，促进RA-FLS细胞的凋亡，抑制其增殖和迁移，降低RA-FLS和CIA大鼠IL-6和TNF-α分泌水平。2-DG还降低CIA大鼠中B、T及NK细胞比例并升高Treg细胞。我们的结果建议糖酵解HK2抑制剂2-DG可以通过抑制关节滑膜细胞活化、抑制其mTOR信号活化、降低炎性免疫细胞比例和炎性细胞因子水平、提升Treg细胞比例实现对RA的治疗效应。HK2是潜在的RA治疗靶点。