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研究目的:本课题旨在探讨TAK1介导TGF-β1诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡中的作用以及相关的分子机制。研究内容包括三个部分:一、观察TGF-β1在巨噬细胞RAW264.7凋亡中的作用和对TLR4受体表达的影响;二、观察TAK1在TGF-β1诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡中的作用;三、探讨TAK1介导TGF-β1诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的相关分子机制。研究方法与结果:本课题实验分三部分进行:第一部分应用流式细胞术检测TGF-β1刺激对巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响,包括以下两个实验:1、分别用5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞12小时,流式细胞仪检测巨噬细胞RAW264.7凋亡情况,结果显示TGF-β1具有诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的作用,且这种作用具有剂量依赖性;2、流式细胞术检测TGF-β1刺激对巨噬细胞RAW264.7TLR4表达的影响,这部分实验分组如下:对照组,LPS组、TGF-β1组、LPS与TGF-β1联合刺激组、anti-TGF-β1中和抗体组,以及LPS与anti-TGF-β1中和抗体联合刺激组,检测结果显示,单独LPS、TGF-β1均能诱导巨噬细胞TLR4表达下降,并且者联合刺激时效应增强,LPS与anti-TGF-β1联合刺激和LPS单独刺激时相比,TLR4表达无明显变化,说明LPS与外源性TGF-β1具有协同抑制TLR4表达的作用。第二部分利用电转染的方法在巨噬细胞RAW264.7中过表达TAKl,流式细胞术检测TAK1对TGF-β1诱导巨噬细胞凋亡的影响,包括以下两个实验:1、分别电转染10μg、15μg空质粒CMV、野生型质粒TAK1以及TAK1突变体TAK1K63W,60h后用lOng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞30min,流式细胞术检测巨噬细胞RAW264.7凋亡情况,结果显示:与空质粒CMV、TAK1突变体TAK1K63W相比,TAK1具有明显抑制TGF-β1诱导巨噬细胞凋亡的作用,以10μg TAK1抑制凋亡效应最明显。2、检测TAK1在TAB1作用下对TGF-β1诱导巨噬细胞细胞凋亡的影响,实验分组如下:Empty plasmid组、TAB1组、TAKl组、TAK1与TAB1共转染组、TAK1K63W组、TAK1K63W与TAB1共转染组,结果显示TAK1具有抑制TGF-β1诱导巨噬细胞细胞凋亡的作用,并且在与TAB1共转染时,TAKl抗凋亡效应进一步增强。第三部分探讨TAK1抑制TGF-β1诱导巨噬细胞凋亡的分子机制,包括以下两个实验:1.TAKl对TGF-β1介导的巨噬细胞分泌TNF-α、IL-10等细胞因子的影响,实验分组如前,转染相应质粒入巨噬细胞,60h后,10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞24小时,ELISA检测炎性细胞因子TNF-α、IL-10,结果显示:与对照组相比,TAK1、TAK1与TAB1共转染组在TGF-β1刺激后TNF-α分泌减少,各转染组IL-10分泌与对照组相比无明显差异。2.检测TAK1对TGF-β1介导的巨噬细胞凋亡相关分子的影响:实验分组如前,转染相应质粒入巨噬细胞,60h后,10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞,提取蛋白,Western blot检测巨噬细胞中caspase-3活化情况,结果显示,对照组在TGF-β1刺激时,caspase-3明显活化,过表达TAK1后caspase-3活化受抑制。结论:1、TGF-β1具有诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的作用,且这种作用呈剂量依赖性;TGF-β1具有抑制巨噬细胞TLR4表达的作用。2、在巨噬细胞RAW264.7中过表达TAK1能抑制TGF-β1诱导的巨噬细胞凋亡效应,TAB1具有促进TAK1抗凋亡效应的作用。3、TAKl抑制TGF-β1介导的巨噬细胞的凋亡与TGF-β1刺激巨噬细胞分泌TNF-α相关,与IL-10无明显相关性;其凋亡信号传导与抑制caspase-3活化相关。