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背景前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen,PSMA)是一种Ⅱ型跨膜蛋白,由胞外C末端、螺旋跨膜结构和胞质N末端构成。由于PSMA的胞外区可被抗体、肽、RNA适配体和小分子识别,使得它成为靶向治疗的理想靶分子。最初发现PSMA在正常前列腺分泌上皮中特异性表达,后来发现PSMA在前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)中的表达明显上调,并且其表达水平与疾病的严重程度密切相关,被认为是前列腺癌的理想治疗靶点。近年来有研究发现,PSMA在其他实体肿瘤中也有表达,比如胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌等,但是在这些肿瘤中,PSMA分布于肿瘤血管而不是肿瘤细胞,因此PSMA除了可以作为前列腺癌的治疗靶点,还可以作为许多肿瘤的抗血管治疗靶点。抗体药物偶联物(Antibody-drug conjugate,ADC)是一种肿瘤靶向治疗的新方法,它将抗体与细胞毒性药物偶联,兼具抗体的高度靶向性与细胞毒性药物的强效杀伤作用,可实现对靶细胞的特异性杀伤,具有广泛的应用前景。课题组前期将一株从人源性酵母展示抗体库中筛选获得的针对PSMA的单链抗体改造成全抗体PSMAb,并证实PSMAb可特异性结合并内化入PSMA阳性细胞,具备开发成ADC的良好前景。目的1.检测并分析PSMA在泌尿系肿瘤中的表达情况;2.检测并分析PSMA在其他肿瘤中的表达情况;3.研究靶向PSMA的抗体偶联药物对前列腺癌的治疗作用。方法1.收集临床前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌的组织标本,进行PSMA的免疫组织化学染色并进行统计分析;收集临床膀胱癌、肾癌的组织标本,制作切片,通过免疫组织化学染色检测CD31和PSMA的表达;收集膀胱癌患者的病例信息,统计分析PSMA的表达与患者临床病理特征的关系,并进一步分析PSMA的表达与患者预后的关系;2.收集临床肝癌、乳腺癌和卵巢癌的组织标本,制作切片,通过免疫组织化学染色检测CD31和PSMA的表达;收集肝癌患者的病例信息,统计分析PSMA的表达与临床病理特征的关系,并进一步分析PSMA的表达与患者预后的关系;3.扩增PSMAb的表达质粒,转染真核细胞进行表达,收集上清纯化抗体;4.利用ELISA检测PSMAb与人源性PSMA和鼠源性PSMA的结合能力;5.将所表达纯化的抗体PSMAb与微管抑制剂MMAE进行偶联,制备抗体偶联药物PSMAb-MMAE;6.利用流式细胞术检测PSMAb-MMAE与前列腺癌细胞系PC3及C4-2的结合能力及促凋亡能力,通过细胞ELISA检测PSMAb-MMAE的亲和力,通过间接免疫荧光检测PSMAb-MMAE的内化活性及对微管的抑制作用,通过Alamar Blue实验测定PSMAb-MMAE的IC50浓度;7.利用裸鼠荷瘤模型在体内验证PSMAb-MMAE对PSMA~+肿瘤的生长抑制;8.通过测量裸鼠体重、检测裸鼠肝肾功指标、对裸鼠重要脏器进行HE染色初步评价PSMAb-MMAE的安全性。结果1.在泌尿系肿瘤中,PSMA在前列腺癌中的表达明显高于前列腺炎和前列腺增生,阳性率达93%;PSMA在膀胱癌、肾癌的新生血管中均有表达,其中在膀胱癌新生血管中的阳性率为60%,其表达水平与膀胱癌患者的肿瘤分化水平、T分级、N分级、TNM分期及Ki67指数等临床病理特征密切相关;PSMA高表达的膀胱癌患者生存期短于PSMA低表达的患者,PSMA的高表达与膀胱癌患者的不良预后密切相关;2.在其他肿瘤中,PSMA在肝癌、乳腺癌和卵巢癌的新生血管中均有表达,其中在肝癌新生血管中的阳性率为76%;PSMA的表达水平与肝癌患者的肿瘤分化水平、T分级、N分级、TNM分期及Ki67指数等临床病理特征密切相关,PSMA高表达的肝癌患者生存期短于PSMA低表达的患者,PSMA的高表达与肝癌患者的不良预后密切相关;3.纯化获得了纯度较高的PSMAb蛋白,但是PSMAb只能结合人源性PSMA,不能结合鼠源性PSMA;成功制备了抗体偶联药物PSMAb-MMAE,PSMAb-MMAE可以特异性结合并内化入PSMA~+的C4-2细胞,亲和力指数Kd值为0.6nM;PSMAb-MMAE可特异性诱导C4-2细胞凋亡,其IC50值为0.59nM;PSMAb-MMAE可以抑制C4-2细胞中微管的形成;PSMAb-MMAE可在体内抑制PSMA~+肿瘤的生长,其对裸鼠体重、肝肾功和重要脏器的组织结构无明显影响。结论PSMA在前列腺癌中高表达,在膀胱癌、肾癌、肝癌、乳腺癌和卵巢癌的新生血管中均有表达,且其表达水平与膀胱癌和肝癌患者的临床病理特征及预后密切相关;抗体偶联药物PSMAb-MMAE可在体外特异性杀伤PSMA阳性细胞,在裸鼠移植瘤模型中对前列腺癌有明显的治疗作用并具有一定的安全性。