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脑缺血后一系列的病理变化导致细胞DNA损伤,损伤的DNA若得不到及时修复导致细胞凋亡,从而加重缺血性脑损伤。缺血在导致DNA损伤的同时,也激活了自身的DNA修复系统。核苷酸剪切修复(nucleotideexcision repair,NER)是细胞内最普遍的DNA修复方式,它可修复各种因素导致的大片断DNA损伤,如紫外线、化学药物及氧化剂导致的DNA损伤。研究表明,剪切修复偶联因子1(excision repair cross complementing1,ERCC1)是NER途径中的核心因子之一,ERCC1缺失的小鼠DNA损伤明显重于野生型小鼠,并在断奶前即死亡。将ERCC1基因转入该缺失型小鼠可明显改善其病理症状。体外实验进一步证实,缺少ERCC1后细胞不能通过NER有效修复损伤的DNA,给予外源性ERCC1可恢复其修复功能。所以,ERCC1可能是NER过程中的一个重要的限速因子。为了研究ERCC1在缺血损伤脑内的表达及可能作用,我们采用免疫组化和Western blot等方法观察了ERCC1在正常大鼠脑内的表达和分布、在缺血脑内的表达及时程变化;为进一步研究ERCC1在缺血脑内表达的生物学意义,我们分别采用全长反义核酸抑制ERCC1表达和质粒转染过表达ERCC1蛋白,从正反两方面分析、研究ERCC1对缺血后DNA损伤修复和脑损伤的影响。现将实验结果概述如下:1.ERCC1在大鼠脑内的表达和细胞分布研究免疫组化的结果显示,ERCC1在大鼠脑内广泛分布,特别是皮层和纹状体。免疫双标结果显示:ERCC1的表达主要位于细胞核,与神经元标志蛋白MAP-2和星型胶质细胞标志蛋白GFAP均有共存,并以前者为多。这些结果表明ERCC1主要存在于神经元和星型胶质细胞的胞核内。2.缺血再灌大鼠脑内ERCC1表达变化的时程研究免疫印迹半定量分析(Western blot,WB)结果显示:皮层ERCC1的表达在缺血再灌1d时显著下降,再灌3d到14d又显著增加;纹状体的ERCC1表达在再灌3d时开始增加,并持续升高到再灌14d。免疫组化的结果显示,缺血再灌1d时,皮层和纹状体内ERCC1蛋白的表达都有一短暂性的下调趋势。随后,皮层ERCC1表达基本恢复至缺血前水平。但是,再灌14 d时,纹状体ERCC1表达显著高于正常水平。进一步观察发现,在缺血再灌1d时ERCC1免疫阳性细胞着色较浅,3d后着色加深,7d和14d时,着色深于正常组。另外,采用免疫组化双标的方法观察到,在缺血再灌14d时,缺血侧的ERCC1分别与MAP-2和GFAP共存。由此可见,缺血诱导脑内高表达ERCC1位于神经元和神经胶质细胞的胞核内。3.降低脑内内源性ERCC1表达加剧缺血性脑损伤大鼠大脑中动脉线栓(middle cerebral artery occlusion,MCAO)30min后,侧脑室内给予不同剂量的ERCC1 antisense质粒(pcDNA3-ERCC1-antisense),动物分别于缺血再灌3 d和7 d时处死。免疫组化和免疫印迹分析结果显示,5μg和10μg pcDNA3-ERCC1-antisense均可显著降低内源性ERCC1蛋白的表达量。并且pcDNA3-ERCC1-antisense处理加剧大鼠皮层和纹状体内单链DNA的损伤,扩大脑梗塞灶体积。由此推测,缺血诱导的内源性ERCC1表达增加与损伤脑的自身修复密切相关。4.过表达ERCC1对缺血损伤脑的保护作用研究大鼠MCAO 30 min后,侧脑室分别给予5μg、10μg、15μg pEGFP-N1或ERCC1-EGFP质粒,EGFP免疫组化显示缺血后侧脑室给予ERCC1质粒可在脑内有效表达。与对照组比较,5μg ERCC1质粒注射后,对缺血损伤脑的梗塞灶体积没有影响,而10μg和15μg ERCC1质粒注射后,可显著缩小脑梗塞灶体积。提示在缺血脑内外源性高表达ERCC1具有明显的脑保护效应。小结:在成年大鼠脑内,ERCC1主要存在于神经元和神经胶质细胞的胞核内。在大鼠脑缺血再灌过程中,ERCC1时间依赖性地表达增加。ERCC1antisense抑制脑内ERCC1表达,可增加缺血损伤脑内单链DNA损伤和脑梗塞灶体积。外源性过表达ERCC1可减轻缺血性脑损伤,缩小脑梗塞灶体积。由此提示,缺血损伤脑内ERCC1表达的增加可能是损伤脑自我保护的内源性代偿机制之一。