血管新生，即在预先存在的血管中长出新生毛细血管的过程。它是多种致盲性新生血管性眼病的共同病理生理基础。血管新生严格地受到促血管因子和抑血管因子平衡的调控。这种平衡的打破，能够促发血管新生的细胞转导信号，引起血管内皮细胞的增生、迁移和存活，从而导致病理性的血管新生。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，作为复杂的血管新生瀑布反应的中心介质和强大的通透性因子，是迄今为止唯一被证实仅对内皮细胞特异性作用的促血管因子，并在血管形成中发挥关键作用。Kringle结构域是一种由约80个氨基酸组成的保守结构，包含三对二硫键，是行使生物学功能的独立折叠单元。现已证实，Kringle结构域存在于包括生长因子、蛋白酶和凝血因子等多种不同功能的蛋白质，如纤溶酶原中。Kringle结构域被认为是首个特异性抑制血管生长的保守结构的组成部分，许多Kringle结构域能够抑制血管新生，如纤溶酶原Kringle 5。脂蛋白(lipoprotein)是血浆中的脂质与特殊蛋白质结合的球状巨分子复合物，脂蛋白中的蛋白质即载脂蛋白(apolipoprotein)。脂蛋白(a)[Lipoprotein(a)，Lp(a)]，含有载脂蛋白B100(ApoB100)和载脂蛋白(a)[Apo(a)]两类载脂蛋白。在包含Kringle结构域的蛋白质中，载脂蛋白(a)(apolipoprotein(a)，apo(a))包含几个随机重复的与纤溶酶原Kringle 4类似的Kringle区域(KringleⅣ)，后面带有一个与纤溶酶原Kringle 5同源的KringleⅤ结构域以及蛋白酶区域。已有一些研究揭示，apo(a)的这些结构也有类似于纤溶酶原相关Kringle结构域的抗新生血管活性，但apo(a)发挥抗血管新生活性的关键区域尚未得到清楚的阐明。因此，确定各结构域的抗血管新生活性位点及其潜在机制，对于更深入地认识包含多Kringle结构的血管生成抑制剂的功能具有重要意义。出于此目的，我们选择apo(a)中与纤溶酶原K5唯一同源的KV结构域，应用生物信息学手段分析预测其氨基酸序列的结构和生物学特性，筛选出其中的一个11肽片段YTMNPRKLFDY，人工合成后观察其对VEGF诱导的小鼠角膜新生血管的作用，初步探讨apo(a)抗新生血管活性区域所在，并为进一步开发治疗眼部新生血管疾病的分子药物奠定基础。第一部分生物信息学分析筛选小肽目的：利用生物信息学的方法，对apo(a)KV的氨基酸序列进行分析，预测其抗新生血管的活性氨基酸位点所在。方法：登陆美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，进入NCBI默认的蛋白质数据库NRDB蛋白质序列复合数据库，查询“apolipoprotein(a)kringle V”。进入网站中的Standard Protein-Protein BLAST(BLASTp)子程序，提交查得的apo(a)KV氨基酸序列。打开Lasergene软件包，进入Protean程序，进行抗原性、表面接触性分析和氨基酸组成分析；打开BioEdit软件包，行氨基酸组成分析和疏水面平均数的计算。综合分析上述结果。结果：在NRDB蛋白质序列复合数据库中查找得到人apo(a)apo(a)KV(4227-4327)序列如下：DCMF GNGKGYRGKK ATTVTGTPCQ EWAAQEPHRH STFIPGTNKW AGLEKNYCRN PDGDINGPWC YTMNPRKLFD YCDIPLCASS SFDCGKPQVE PKKCPGS。BLAST程序分析该序列显示了apo(a)KV与纤溶酶原K5含有85％的相同氨基酸残基，91％的相似氨基酸残基(Expect=le-51)。推测apo(a)KV中保守氨基酸分布较集中的区域可能存在抗新生血管活性位点。根据上述同源性比较结果，结合apo(a)KV空间结构，以二硫键为界，将apo(a)KV分成4个肽段，依次为Pept 1—Pept 4，分别进行生物学特性分析。抗原性分析显示，在apo(a)KV第5—15、50—60、65—75、90—100氨基酸残基区域出现较大的抗原性波峰，这些区域分别位于Pept 1大部分、Pept 3前段和Pept 4全段。在表面接触性分析中，在apo(a)KV第10—15、30—35、65—75、90—95氨基酸残基区域出现表面接触性波峰，对应的区域为Pept 1中段、Peot 2前段和Pept4全段。疏水性分析显示，Pept 3和Pept4各形成一个亲水性谷底。Pept 1—Pept 4中疏水性氨基酸(AILFWV)所占分子量的比重依次为15.33％、29.10％、24.16％和18.00％。结论：在apo(a)KV的各个肽段中，Pept 4含有较大比例的保守残基，且较其他三个肽段有良好的反应特性，包括抗原性、表面接触活性和亲水性等，故推测Pept 4，即小肽YTMNPRKLFDY，可能与apo(a)KV的抑制活性有关，具有抗新生血管的作用。第二部分小鼠角膜微囊袋模型的建立目的：以含有VEGF的缓释颗粒作为直接刺激因子诱导小鼠角膜新生血管，建立小鼠角膜微囊袋非炎症性新生血管模型。方法：将12％PolyHEMA乙醇溶液与含有硫糖铝粉末的生理盐水溶液等体积混合后制成0.35mm×0.35mm大小的空白缓释颗粒，并在上述颗粒中加入160 ng VEGF，形成含有160ng／粒的VEGF缓释颗粒。无菌条件下，在实验眼角膜基质层间行钝性分离，将VEGF缓释颗粒和空白缓释颗粒分别植入小袋内。术后每天观察实验眼至角膜新生血管出现后，改为隔日观察，测定角膜最大新生血管长度、新生血管钟点数和新生血管面积，并行小鼠角膜病理组织学检查。结果：移植有VEGF缓释颗粒的小鼠角膜，术后24h内手术部位的角膜上皮趋于愈合，角膜基质轻到中度水肿。术后3d，角巩缘的血管轻度扩张，开始向移植有VEGF缓释颗粒的透明角膜生长，未见渗出等炎症表现。术后5-7d，角膜新生血管逐渐朝向缓释颗粒生长旺盛，血管迂曲扩张，于术后7d达到高峰。术后8d开始，角膜新生血管不再继续生长，开始退化，新生血管丛变稀疏，管腔变细、萎缩，颜色变浅。移植有空白缓释颗粒的小鼠角膜，术后24h内手术部位的角膜上皮趋于愈合，角膜基质轻到中度水肿。术后3d，角膜水肿基本消退，未见渗出等炎症表现，角巩缘血管未见明显改变。术后观察2w，均未见新生血管生成。结论：本实验所采用的小鼠角膜微囊袋模型，其新生血管直接由VEGF诱导，排除了炎症反应的干扰，这对于特定的新生血管抑制剂的疗效评价具有重要的意义，同时便于定量分析，稳定性和重复性好。第三部分合成小肽对VEGF诱导小鼠角膜新生血管作用研究目的：将生物信息学筛选的小肽人工合成后，应用小鼠角膜微囊袋模型，评价其对VEGF诱导小鼠角膜新生血管的作用。方法：采用12通道多肽合成仪按照小肽的氨基酸序列编辑程序固相合成小肽，并行高效液相色谱纯化。将12％PolyHEMA乙醇溶液与含有硫糖铝粉末的生理盐水溶液等体积混合后制成0.35mm×0.35mm大小的空白缓释颗粒，并在上述颗粒中加入160ng VEGF和不同剂量的小肽(0μg，0.5μg．1μg和1.5μg)，及仅加入1μg小肽。每只实验小鼠均以右眼为实验眼，按照随机数字表法，将50只眼随机分成5组，每组10只眼。无菌条件下，在实验眼角膜基质层间行钝性分离，形成—0.5mm×0.5mm小袋，分别植入包含160ng VEGF与0μg、0.5μg、1.0μg和1.5μg小肽的缓释颗粒，依次作为对照组、A组、B组和C组，植入1μg小肽的缓释颗粒作为D组。术后7d摄片观察测定角膜最大新生血管长度、新生血管钟点数和新生血管面积，小鼠角膜病理组织学检查。结果：YTMNPRKLFDY，是一个包含11个氨基酸残基的小肽，由于其分子量较小，因而可通过固相合成获得，并进行HPLC纯化，冻干获得纯度大于95％的白色粉末，水溶性好。对照组角膜新生血管自角巩缘朝向缓释颗粒生长浓密，迂曲扩张。A组角膜新生血管生长旺盛，与对照组比较，在最长血管长度、钟点数和面积上差异均无统计学意义(P＞0.05)。B组角膜可见短小稀疏的新生血管自角巩缘生长，管径较细，与对照组比较，在最长血管长度、钟点数和面积上差异均有统计学意义(P＜0.01)。C组角膜自角巩缘处未见明显粗大的新生血管长成，与对照组比较，在最长血管长度、钟点数和面积上差异有统计学意义(P＜0.01)，与B组比较，在上述3个指标上差异无统计学意义(P＞0.05)。术后观察2w，D组小鼠角巩缘血管未见明显改变，均未见新生血管生成。结论：小肽，YTMNPRKLFDY，在一定剂量时对VEGF诱导的小鼠角膜新生血管有明显抑制作用，该氨基酸序列可能位于apo(a)KV抗新生血管的活性位点内。