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血管新生,即在预先存在的血管中长出新生毛细血管的过程。它是多种致盲性新生血管性眼病的共同病理生理基础。血管新生严格地受到促血管因子和抑血管因子平衡的调控。这种平衡的打破,能够促发血管新生的细胞转导信号,引起血管内皮细胞的增生、迁移和存活,从而导致病理性的血管新生。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),作为复杂的血管新生瀑布反应的中心介质和强大的通透性因子,是迄今为止唯一被证实仅对内皮细胞特异性作用的促血管因子,并在血管形成中发挥关键作用。Kringle结构域是一种由约80个氨基酸组成的保守结构,包含三对二硫键,是行使生物学功能的独立折叠单元。现已证实,Kringle结构域存在于包括生长因子、蛋白酶和凝血因子等多种不同功能的蛋白质,如纤溶酶原中。Kringle结构域被认为是首个特异性抑制血管生长的保守结构的组成部分,许多Kringle结构域能够抑制血管新生,如纤溶酶原Kringle 5。脂蛋白(lipoprotein)是血浆中的脂质与特殊蛋白质结合的球状巨分子复合物,脂蛋白中的蛋白质即载脂蛋白(apolipoprotein)。脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)],含有载脂蛋白B100(ApoB100)和载脂蛋白(a)[Apo(a)]两类载脂蛋白。在包含Kringle结构域的蛋白质中,载脂蛋白(a)(apolipoprotein(a),apo(a))包含几个随机重复的与纤溶酶原Kringle 4类似的Kringle区域(KringleⅣ),后面带有一个与纤溶酶原Kringle 5同源的KringleⅤ结构域以及蛋白酶区域。已有一些研究揭示,apo(a)的这些结构也有类似于纤溶酶原相关Kringle结构域的抗新生血管活性,但apo(a)发挥抗血管新生活性的关键区域尚未得到清楚的阐明。因此,确定各结构域的抗血管新生活性位点及其潜在机制,对于更深入地认识包含多Kringle结构的血管生成抑制剂的功能具有重要意义。出于此目的,我们选择apo(a)中与纤溶酶原K5唯一同源的KV结构域,应用生物信息学手段分析预测其氨基酸序列的结构和生物学特性,筛选出其中的一个11肽片段YTMNPRKLFDY,人工合成后观察其对VEGF诱导的小鼠角膜新生血管的作用,初步探讨apo(a)抗新生血管活性区域所在,并为进一步开发治疗眼部新生血管疾病的分子药物奠定基础。第一部分生物信息学分析筛选小肽目的:利用生物信息学的方法,对apo(a)KV的氨基酸序列进行分析,预测其抗新生血管的活性氨基酸位点所在。方法:登陆美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)网站主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),进入NCBI默认的蛋白质数据库NRDB蛋白质序列复合数据库,查询“apolipoprotein(a)kringle V”。进入网站中的Standard Protein-Protein BLAST(BLASTp)子程序,提交查得的apo(a)KV氨基酸序列。打开Lasergene软件包,进入Protean程序,进行抗原性、表面接触性分析和氨基酸组成分析;打开BioEdit软件包,行氨基酸组成分析和疏水面平均数的计算。综合分析上述结果。结果:在NRDB蛋白质序列复合数据库中查找得到人apo(a)apo(a)KV(4227-4327)序列如下:DCMF GNGKGYRGKK ATTVTGTPCQ EWAAQEPHRH STFIPGTNKW AGLEKNYCRN PDGDINGPWC YTMNPRKLFD YCDIPLCASS SFDCGKPQVE PKKCPGS。BLAST程序分析该序列显示了apo(a)KV与纤溶酶原K5含有85%的相同氨基酸残基,91%的相似氨基酸残基(Expect=le-51)。推测apo(a)KV中保守氨基酸分布较集中的区域可能存在抗新生血管活性位点。根据上述同源性比较结果,结合apo(a)KV空间结构,以二硫键为界,将apo(a)KV分成4个肽段,依次为Pept 1—Pept 4,分别进行生物学特性分析。抗原性分析显示,在apo(a)KV第5—15、50—60、65—75、90—100氨基酸残基区域出现较大的抗原性波峰,这些区域分别位于Pept 1大部分、Pept 3前段和Pept 4全段。在表面接触性分析中,在apo(a)KV第10—15、30—35、65—75、90—95氨基酸残基区域出现表面接触性波峰,对应的区域为Pept 1中段、Peot 2前段和Pept4全段。疏水性分析显示,Pept 3和Pept4各形成一个亲水性谷底。Pept 1—Pept 4中疏水性氨基酸(AILFWV)所占分子量的比重依次为15.33%、29.10%、24.16%和18.00%。结论:在apo(a)KV的各个肽段中,Pept 4含有较大比例的保守残基,且较其他三个肽段有良好的反应特性,包括抗原性、表面接触活性和亲水性等,故推测Pept 4,即小肽YTMNPRKLFDY,可能与apo(a)KV的抑制活性有关,具有抗新生血管的作用。第二部分小鼠角膜微囊袋模型的建立目的:以含有VEGF的缓释颗粒作为直接刺激因子诱导小鼠角膜新生血管,建立小鼠角膜微囊袋非炎症性新生血管模型。方法:将12%PolyHEMA乙醇溶液与含有硫糖铝粉末的生理盐水溶液等体积混合后制成0.35mm×0.35mm大小的空白缓释颗粒,并在上述颗粒中加入160 ng VEGF,形成含有160ng/粒的VEGF缓释颗粒。无菌条件下,在实验眼角膜基质层间行钝性分离,将VEGF缓释颗粒和空白缓释颗粒分别植入小袋内。术后每天观察实验眼至角膜新生血管出现后,改为隔日观察,测定角膜最大新生血管长度、新生血管钟点数和新生血管面积,并行小鼠角膜病理组织学检查。结果:移植有VEGF缓释颗粒的小鼠角膜,术后24h内手术部位的角膜上皮趋于愈合,角膜基质轻到中度水肿。术后3d,角巩缘的血管轻度扩张,开始向移植有VEGF缓释颗粒的透明角膜生长,未见渗出等炎症表现。术后5-7d,角膜新生血管逐渐朝向缓释颗粒生长旺盛,血管迂曲扩张,于术后7d达到高峰。术后8d开始,角膜新生血管不再继续生长,开始退化,新生血管丛变稀疏,管腔变细、萎缩,颜色变浅。移植有空白缓释颗粒的小鼠角膜,术后24h内手术部位的角膜上皮趋于愈合,角膜基质轻到中度水肿。术后3d,角膜水肿基本消退,未见渗出等炎症表现,角巩缘血管未见明显改变。术后观察2w,均未见新生血管生成。结论:本实验所采用的小鼠角膜微囊袋模型,其新生血管直接由VEGF诱导,排除了炎症反应的干扰,这对于特定的新生血管抑制剂的疗效评价具有重要的意义,同时便于定量分析,稳定性和重复性好。第三部分合成小肽对VEGF诱导小鼠角膜新生血管作用研究目的:将生物信息学筛选的小肽人工合成后,应用小鼠角膜微囊袋模型,评价其对VEGF诱导小鼠角膜新生血管的作用。方法:采用12通道多肽合成仪按照小肽的氨基酸序列编辑程序固相合成小肽,并行高效液相色谱纯化。将12%PolyHEMA乙醇溶液与含有硫糖铝粉末的生理盐水溶液等体积混合后制成0.35mm×0.35mm大小的空白缓释颗粒,并在上述颗粒中加入160ng VEGF和不同剂量的小肽(0μg,0.5μg.1μg和1.5μg),及仅加入1μg小肽。每只实验小鼠均以右眼为实验眼,按照随机数字表法,将50只眼随机分成5组,每组10只眼。无菌条件下,在实验眼角膜基质层间行钝性分离,形成—0.5mm×0.5mm小袋,分别植入包含160ng VEGF与0μg、0.5μg、1.0μg和1.5μg小肽的缓释颗粒,依次作为对照组、A组、B组和C组,植入1μg小肽的缓释颗粒作为D组。术后7d摄片观察测定角膜最大新生血管长度、新生血管钟点数和新生血管面积,小鼠角膜病理组织学检查。结果:YTMNPRKLFDY,是一个包含11个氨基酸残基的小肽,由于其分子量较小,因而可通过固相合成获得,并进行HPLC纯化,冻干获得纯度大于95%的白色粉末,水溶性好。对照组角膜新生血管自角巩缘朝向缓释颗粒生长浓密,迂曲扩张。A组角膜新生血管生长旺盛,与对照组比较,在最长血管长度、钟点数和面积上差异均无统计学意义(P>0.05)。B组角膜可见短小稀疏的新生血管自角巩缘生长,管径较细,与对照组比较,在最长血管长度、钟点数和面积上差异均有统计学意义(P<0.01)。C组角膜自角巩缘处未见明显粗大的新生血管长成,与对照组比较,在最长血管长度、钟点数和面积上差异有统计学意义(P<0.01),与B组比较,在上述3个指标上差异无统计学意义(P>0.05)。术后观察2w,D组小鼠角巩缘血管未见明显改变,均未见新生血管生成。结论:小肽,YTMNPRKLFDY,在一定剂量时对VEGF诱导的小鼠角膜新生血管有明显抑制作用,该氨基酸序列可能位于apo(a)KV抗新生血管的活性位点内。