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DENN(differentially expressed in normal and neoplastic cells)结构域是一种进化上高度保守的蛋白模块。DENN结构域蛋白的主要功能是作为Rab蛋白的鸟苷酸交换因子(GEF)催化Rab蛋白的激活。Rab是一类小G蛋白,在活跃的GTP结合状态和无活性的GDP结合状态之间切换。Rab蛋白在细胞内膜运输过程中起着分子开关的作用,调控货物蛋白富集、囊泡运动和靶向膜锚定等重要步骤。FAM45A蛋白是一种新型的DENN结构域蛋白,进化上起源很早,存在于阿米巴、海胆、以及大多数昆虫和脊椎动物中,但目前还无相关功能的研究报道。实验室前期数据表明,FAM45A定位于多囊泡胞内体(multiple vesicular endosome,MVE)和溶酶体,揭示FAM45A在细胞内囊泡运输通路中的晚胞内体/溶酶体阶段发挥作用。在本研究中,我们构建了FAM45A基因沉默稳转细胞系,发现FAM45A敲降导致:1)细胞的早胞内体、晚胞内体向细胞核周围聚集;2)EGF受体的内吞过程变缓,在早胞内体向晚胞内体转换时受阻;3)外泌体分泌减少。以上表型说明FAM45A介导晚胞内体的稳态和运动。为了揭示FAM45A的工作机制,我们通过免疫共沉淀检验了FAM45A与Rab蛋白的相互作用,发现FAM45A与Rab27b存在于同一蛋白复合物,提示FAM45A通过激活Rab27b等蛋白调控晚胞内体的动态变化。目的:研究FAM45A在囊泡转运中的功能及其作用机制。方法:一、FAM45A基因沉默后对囊泡转运通路的影响1.构建FAM45A基因沉默细胞系和FAM45A基因敲除细胞系包装FAM45A shRNA和FAM45A CRISPR sgRNA慢病毒颗粒,侵染Hela细胞,利用puromycin筛选稳转细胞系。利用q-PCR和Western Blotting(WB)分别检测FAM45A在mRNA水平和蛋白质水平上的变化。2.研究FAM45A基因沉默后细胞器形态变化在稳转细胞系中,利用EEA1、CD63抗体标记早胞内体、晚胞内体,利用Lysotracker标记溶酶体,检验FAM45A下调表达后对早胞内体、晚胞内体和溶酶体表型的影响。3.研究FAM45A基因沉默后对EGFR降解的影响用EGF分别刺激饥饿后的FAM45A基因沉默细胞系及对照细胞系,在0,10,90,150min固定细胞,利用免疫荧光技术,用EGFR抗体标记EGFR的定位,与早胞内体(mCherry-EEA1标记),晚胞内体(CD63抗体标记)和溶酶体(Lamp1抗体标记)通过双色荧光定位比较,检验FAM45A表达下调后EGFR内吞过程中的动态变化。4.研究FAM45A基因沉默后对外泌体分泌的影响采用ExtraPEG的方法提取FAM45A基因沉默细胞系及对照细胞系的外泌体,利用Western Blotting(WB)检测外泌体中是否存在FAM45A及外泌体的分泌水平。二、FAM45A的作用机制在HEK293T细胞中共表达3xFLAG-FAM45A和Citrine-Rab融合蛋白,通过免疫共沉淀技术,检测FAM45A与Rab27b是否有相互作用。结果:一、FAM45A基因沉默后对囊泡转运通路的影响1.成功构建FAM45A基因沉默细胞系及基因敲除细胞系,经q-PCR和WB检测,FAM45A基因沉默细胞系中FAM45A的mRNA和蛋白表达水平均显著下降。FAM45A基因敲除细胞中FAM45A的mRNA表达水平显著下降(受商业抗体来源限制,蛋白水平目前无法检测)。2.FAM45A基因沉默后导致EEA1标记的早胞内体和CD63标记的晚胞内体的分布更靠近细胞核;对Lamp1标记的溶酶体的分布影响不明显;对Lysotracker染料标记的酸性胞内体形态没有影响。3.FAM45A表达下调导致EGFR降解变慢,在EGF刺激150分钟时,FAM45A基因沉默细胞系中部分EGFR仍被滞留在早胞内体中。4.外泌体中没有检测到FAM45A蛋白,但FAM45A表达下调后导致外泌体分泌减少。二、FAM45A的作用机制用FLAG抗体免疫沉淀3xFLAG-FAM45A可同时沉淀Citrine-Rab27b。结论:1.FAM45A敲降导致胞内体向核方向聚集,表明FAM45A参与囊泡在细胞内的运动。2.FAM45A敲降导致EGF受体内吞时滞留于早胞内体,说明FAM45A在早胞内体向晚胞内体转换的过程中起着重要作用。3.外泌体起源于晚胞内体与质膜的融合。FAM45A敲降导致外泌体分泌减少,说明FAM45A在外泌体生物发生机制中起着重要作用。4.免疫共沉淀实验表明FAM45A与Rab27b存在同一蛋白复合体中,提示FAM45A可能通过激活Rab27b等小G蛋白调控囊泡转运通路。综上所述,FAM45A蛋白是一种此前未报道的新型DENN结构域蛋白,本研究发现FAM45A对于晚胞内体的运动和稳态起着重要作用,其功能可能是通过激活Rab27b等小G蛋白来完成的。