论文部分内容阅读
背景和目的恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病，且发生率呈逐年上升的趋势。肿瘤的治疗一直是全世界关注的课题，目前手术、放疗和化疗仍为恶性肿瘤治疗的主要手段，但由于其毒副作用、适应证范围的限制等因素存在其治疗的局限性。中医药在肿瘤治疗领域中有其独特的功效，无论在抑制或杀伤肿瘤细胞方面，还是术后调理，减轻放、化疗不良反应，改善症状和体征，提高生存质量等方面，均发挥了重要的作用。中药以其无明显毒副作用、价格低廉、应用历史悠久等优点在治疗肿瘤方面显示了日益重要的作用地位，越来越受到广大学者、患者的重视和接受。中药治疗肿瘤有一定的疗效，可提高机体免疫功能，对化、放疗起减毒、增效的作用，有预防肿瘤复发转移，阻断癌前病变之功效且毒副作用轻。所以近年来对中药治疗肿瘤的研究也越来越多。抑瘤宁是治疗消化系统肿瘤的一个临床验方，为纯中药复方制剂，由Rab、Aca、Sol、Duc四味中药构成。具有抗癌抑增，清热解毒，消肿散结，补益健脾的功能，临床治疗晚期食管癌、贲门-胃底癌、肝癌及胰腺癌有较好疗效，无明显毒副作用。其方剂中Rab、Duc、Sol皆为清热解毒类药物，Aca有增加机体的免疫和抗癌作用。前期实验研究表明Rab与Duc两药联用和Rab、Aca、Sol、Duc四药联用体外能明显地抑制消化系统肿瘤细胞的生长；四药联用时，能使人食管癌Eca-109细胞阻滞于S期，并诱导细胞凋亡。目前对非消化系统肿瘤细胞作用尚无研究。本课题在前期实验研究基础之上以人乳腺癌MDA-MB-231、人肺癌NCI-H520、人肺癌A549、人宫颈癌Hela四种细胞为观察对象，通过进行细胞形态学观察，生长抑制率测定及流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率进一步探讨抑瘤宁对非消化系统癌细胞的增殖抑制作用，最佳方剂组成及用药剂量，为临床应用抑瘤宁治疗非消化系统实体瘤提供实验依据。方法1药物的制备按照相关文献提取方法提取各成分的粗提物。实验中用培养液将粗提物稀释成不同浓度。药物浓度=草药重量／培养液体积。2细胞培养将MDA-MB-231、NCI-H520、A549、Hela细胞分别接种于含体积分数10％灭活胎牛血清的L15、RPMI-1640、F12、高糖DMEM培养液中。在37℃、体积分数5％CO2、相对湿度为体积分数95％的细胞培养箱中常规培养。1～2d换液一次，1～2d或2～3d传代。3细胞生长抑制率的测定取MDA-MB-231、NCI-H520、A549、Hela对数生长期的细胞，分别以1×105／ml、5×104／ml、5×104／ml、5×104／ml细胞浓度接种于96孔板上，每孔200μl，培养24h后，以抑瘤宁不同药物搭配处理细胞为实验组，每组6个平行孔，设调零孔，空白对照孔和本底对照孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，采用噻唑蓝（MTT）还原法检测实验组细胞生长抑制率。重复实验3次（n=18）。4细胞形态学观察倒置显微镜下观察比较实验组与对照组在细胞形态学区别。5流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率6统计学分析采用统计软件SPSS10.0，采用单因素方差分析及x2检验对数据进行分析，以α=0.05为检验水准。结果1抑瘤宁对四种非消化系统癌细胞的生长抑制作用1．1对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用以“Rab（2mg／ml）+Duc（0.4mg／ml）+Sol（0.4mg／ml）+Aca（0.4mg／ml）”四药联用时细胞生长抑制率最高，用药剂量最少，抑制率可达99.74％。1．2对NCI-H520细胞的生长抑制作用以“Rab（2mg／ml）+Duc（1mg／ml）+Sol（1mg／ml）+Aca（1mg／ml）”四药联用时细胞生长抑制率最高，用药剂量最少，抑制率可达96.41％。1．3对A549细胞的生长抑制作用以“Rab（3mg／ml）+Duc（0.8mg／ml）+Sol（0.8mg／ml）+Aca（0.8mg／ml）”四药联用时细胞生长抑制率最高，用药剂量最少，抑制率可达80.62％。1．4对Hela细胞的生长抑制作用以“Rab（2mg／ml）+Duc（1mg／ml）+Sol（1mg／ml）+Aca（1mg／ml）”四药联用时细胞生长抑制率最高，用药剂量最少，抑制率可达97.98％。2对照组：MDA-MB-231细胞呈梭形，贴壁生长，细胞透亮，生长状态良好。四药联用组：细胞相互分离，贴壁大量减少，细胞皱缩，体积缩小，可见大量细胞崩解碎片，死亡。3抑瘤宁作用于体外培养的MDA-MB-231细胞后，四药联用组S期细胞百分率明显升高；G0／G1期细胞百分比明显下降；细胞被阻滞于S期；细胞凋亡率升高。与空白对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论1 Rab、Duc、Sol、Aca四药联用能明显地抑制MDA-MB-231、NCI-H520、A549、Hela细胞的生长。2 Rab、Duc、Sol、Aca四药联用时，能使MDA-MB-231细胞阻滞于S期，诱导细胞凋亡。3 Rab+Duc+Sol+Aca四药联用时，细胞毒作用增加，用药剂量明显减少，有协同抗肿瘤作用。4抑瘤宁的最佳方剂组成是Rab+Duc+Sol+Aca四药联用。