研究背景阿尔茨海默病(AD)是老年期痴呆的最常见原因,其是以进行性认知功能障碍为主要特征的中枢神经系统退行性疾病,严重危害老年人群健康。AD的确切发病机制仍在研究中,其中较为公认的学说为Aβ级联假说。β淀粉样蛋白(Aβ)沉积所形成的老年斑(SP)是AD最主要的病理变化,可以诱发脑内氧化应激、激活神经炎症反应、促进细胞凋亡、引起Aβ代谢紊乱、降低神经元突触可塑性等。目前AD缺乏有效的防治药物,相关治疗药物的研发已成为亟需解决的问题。番茄红素广泛存在于西红柿和其它红色的水果中,属于类胡萝卜素家族。番茄红素作为一种有效的抗氧化剂和单线态氧淬灭剂,可以发挥多种生理作用,如抗氧化应激、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等。已有研究证明,番茄红素对多种中枢神经系统疾病有神经保护作用。但由于番茄红素的溶解度很低、易于氧化、口服生物利用度低,其在治疗神经系统疾病中的应用受到了限制。因而,研究新的剂型来提高番茄红素的溶解度、稳定性、口服生物利用度和脑靶向作用具有重要意义。微乳是由油相、表面活性剂、助表面活性剂、水相混合后形成的一种热力学稳定体系,粒径小于1OOnm。由于微乳粒径小、分散均匀,且可明显提高脂溶性药物的溶解度和生物活性物质的稳定性,该体系已被广泛作为给药的载体。研究表明,特定组成的微乳可以提高难溶性药物的口服生物利用度及促进药物脑靶向转运。因此,微乳体系是番茄红素口服给药的良好选择,研制特定组成的载药微乳可实现脑靶向药物传输而发挥神经保护作用。研究目的本研究拟通过处方优选,研制番茄红素微乳(LME)制剂,并对LME多项特性进行观察研究;以橄榄油溶解的番茄红素(LOO)传统制剂作为对照,通过体内药代动力学、体内组织分布与脑靶向研究,分析LME的体内代谢特点,评估LME 口服生物利用度和脑靶向性;通过侧脑室立体定位注射,建立Aβ损伤动物模型,通过对脑组织氧化应激、神经炎症反应、细胞凋亡、Aβ相关代谢、突触可塑性等多方面的研究,探讨LME对Aβ损伤的神经保护作用。通过以上系列研究,研制一种能提高生物利用度、理化特性优良并具有脑靶向性的口服番茄红素微乳制剂,为AD治疗研究提供实验依据,并为更多药物脑靶向治疗研究提供新的思路和方案。研究方法一、番茄红素微乳的制备与特性研究1.番茄红素高效液相色谱分析方法的建立通过番茄红素检测波长的选择、色谱条件、方法专属性、番茄红素标准曲线建立、精密度、方法回收率和稳定性等系列考察,建立番茄红素高效液相色谱(HPLC)分析方法,检测油相中番茄红素溶解度和LME中番茄红素含量。2.微乳组分初选根据本研究的需要,对微乳组分包括油相、表面活性剂、助表面活性剂进行初选。检测番茄红素在六种油相((R)-(+)-苎烯、油酸乙酯、油酸、橄榄油、大豆油、玉米油)中的溶解度,根据溶解度初选三种油相;吐温80因其良好的乳化能力、合适的亲水亲脂平衡值(HLB=15)、药用的良好安全性和包被的纳米微粒具有明显的脑靶向性而被选为表面活性剂;选择具有良好组织相容性和药用安全性的Transcutol HP、聚乙二醇400(PEG 400)、甘油作为助表面活性剂,进行进一步实验。3.正交试验与伪三元相图构建在微乳组分初选的基础上,选择影响微乳制备的三个主要因素:油相、助表面活性剂、表面活性剂与助表面活性剂比值(Km)作为正交试验的三因素,每个因素取三水平,按照L9(34)正交试验表进行正交试验。取表面活性剂与助表面活性剂以不同比值(Km=2:1、3:2、3:1)分别混合均匀,形成混合表面活性剂(Smix),然后取不同油相和 Smix,分别以 9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9(w/w)的比例混合,采用加水滴定法制备空白微乳(不含番茄红素)。按照油相、Smix和水相在滴定临界点处的质量百分比,采用OriginPro 8.5软件绘制空白微乳伪三元相图,以微乳区面积作为评价指标,优选空白微乳处方,确定微乳组成成分。4.番茄红素微乳制备与处方优选采用优选空白微乳处方制备的空白微乳中,油相与Smix比为1:9和2:8的空白微乳表现出良好的稳定性,而油相与Smix比为3:7～9:1的空白微乳放置离心后出现少许沉淀。为此,采用加水滴定法制备油相与Smix比为1:9和2:8的LME样品,通过物理稳定性、微乳粒径、多分散指数(PDI)、Zeta电位、药物含量与Smix比率等方面的考察,优选LME处方。5.番茄红素微乳特性研究对LME物理稳定性、微乳粒径、PDI、Zeta电位、药物含量、微观形态、存放稳定性等特性进行观察研究,对LME进行质量评价。其中微观形态采用电子显微镜观察;存放稳定性考察采用如下方法:制备LME并同时配制LOO样品,充氮密封,分别置于4℃和室温(25℃)下避光存放8w,观察LME存放稳定性,并与LOO比较。二、番茄红素微乳体内药代动力学研究1.血浆番茄红素HPLC分析方法的建立通过番茄红素色谱条件、血浆样品处理、方法专属性、血浆标准曲线建立、精密度和准确度、提取回收率、血浆样品稳定性等系列考察,建立大鼠血浆番茄红素HPLC分析方法。2.药代动力学动物实验雄性Wistar大鼠12只,随机分为实验组(LME组)和对照组(LOO组),每组6只。两组大鼠分别以LME和LOO灌胃给药,药物剂量为8mg/kg体重(以番茄红素计),于给药后不同时间点分别颈静脉取血,分离血浆,采用HPLC分析方法检测血浆番茄红素浓度。3.实验数据统计分析统计大鼠药物灌胃后各时间点血浆药物浓度,绘制血浆药-时曲线,采用非房室分析,利用DAS 2.0软件计算药代动力学参数,包括药-时曲线下面积(AUC)、峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT)、清除率(CL),其中,Cmax和Tmax采用实验实测值。计算番茄红素相对生物利用度。三、番茄红素微乳体内组织分布与脑靶向研究1.体内组织番茄红素HPLC分析方法的建立通过番茄红素色谱条件、组织样品处理、方法专属性、组织标准曲线建立、精密度和准确度、提取回收率、组织样品稳定性等系列考察,建立小鼠血浆、脑、肝、肾、心、肺、脾组织番茄红素HPLC分析方法。2.动物试验雄性C57BL/6小鼠96只,随机分为实验组(LME组)和对照组(LOO组),每组48只,两组小鼠分别以LME和LOO灌胃给药,药物剂量为8mg/kg体重(以番茄红素计),于给药后不同时间点分别取小鼠6只,取血分离血浆,处死小鼠后分别取脑、肝、肾、心、肺、脾组织,采用HPLC分析方法检测各组织番茄红素浓度。3.药物在小鼠体内组织分布根据小鼠药物灌胃后各时间点血浆、脑、肝、肾、心、肺、脾组织中药物浓度,分别绘制各组织药-时曲线,采用非房室分析,利用DAS 2.0软件计算各组织药代动力学参数,包括AUC、Cmax、Tmax、t1/2、MRT,其中,Cmax和Tmax采用实验实测值。分析药物在小鼠血浆、脑、肝、肾、心、肺、脾等组织的分布情况。4.药物脑组织靶向性研究根据小鼠灌胃给药后脑组织及血浆、肝、肾、心、肺、脾等组织的药物分布情况,以相对摄取率(Re)、峰浓度比(Ce)和药物靶向指数(DTI)为靶向性参数,评价LME对脑组织及其他组织的靶向性。四、番茄红素微乳对Aβ损伤的神经保护作用研究1.动物实验雄性C57BL/6小鼠48只,随机分为假手术组(NC组)、Aβ模型组(Aβ组)、LME治疗组(Aβ+LME组)和LOO治疗组(Aβ+LOO组),每组12只。各组小鼠行侧脑室立体定位注射术,其中NC组小鼠侧脑室注射2μL PBS(pH7.4),Aβ组、Aβ+LME组和Aβ+LOO组小鼠侧脑室注射2μL Aβ溶液(1mg/mL)。手术lw后,Aβ+LME组和Aβ+LOO组分别以LME和LOO灌胃给药,每日药物剂量为4mg/kg体重(以番茄红素计),NC组和Aβ组小鼠以等量生理盐水灌胃,各组小鼠连续灌胃3w。2.脑组织样品处理小鼠灌胃结束后,每组取3只小鼠,麻醉状态下,先后以生理盐水、4%多聚甲醛溶液经心脏灌注,取出鼠脑,在4%多聚甲醛溶液中固定。然后对小鼠脑组织进行脱水、透明、石蜡包埋处理,做冠状位组织切片,用于免疫组织化学检测。各组其余小鼠进行生理盐水经心脏灌注后,取出鼠脑,于-80℃下保存,用于脑组织氧化应激、western blotting等检测。3.脑组织氧化应激水平检测采用硫代巴比妥酸法(TBA法)检测脑组织丙二醛(MDA)含量,分别采用羟胺法、紫外比色法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力水平,观察LME对脑组织氧化应激的作用。4.神经炎症反应指标检测胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)、离子钙接头分子1(Iba1)分别是脑组织主要的炎症反应细胞——星形胶质细胞和小胶质细胞表达的标志性蛋白,可作为神经炎症反应的指标。分别采用免疫组织化学和western blotting方法检测脑组织GFAP、Ibal表达水平,分析药物对神经炎症反应的影响。5.脑组织细胞凋亡标志物检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)具有抑制细胞凋亡作用,Bcl-2相关X蛋白(Bax)具有诱导细胞凋亡作用,Bax/Bcl-2比率是影响细胞凋亡的重要因素;半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)是多种凋亡通路下游最关键的凋亡蛋白酶,Caspase-3被激活而最终引发凋亡。采用western blotting方法检测脑组织Bcl-2、Bax的表达水平,计算Bax/Bcl-2比率,采用微量分光光度法测定脑组织中Caspase-3的酶活力水平,观察LME对脑组织细胞凋亡的影响。6.脑组织Aβ相关代谢检测Aβ由β淀粉样前体蛋白(APP)代谢产生,而APP在脑组织中的分解代谢可分为Aβ通路和非Aβ通路,β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)和解整合素样金属蛋白酶10(ADAM10)分别是Aβ通路和非AP通路的主要代谢酶。采用western blotting方法分别检测脑组织APP、BACE1、ADAM10的表达水平,分析LME对脑组织Aβ相关代谢的影响。7.神经元突触可塑性相关蛋白检测突触素(Syn)是突触前囊泡膜上的一种可结合钙离子的糖蛋白,突触后致密物95(PSD-95)是突触后膜致密区的一种支架蛋白,两者均是重要的神经元突触可塑性相关蛋白。采用western blotting方法检测脑组织Syn和PSD-95的表达水平,分析药物对神经元突触可塑性的影响。研究结果一、番茄红素微乳的制备与特性研究1.空白微乳和番茄红素微乳制备处方优选在微乳组分初选的基础上,通过正交试验和伪三元相图构建,以微乳区面积作为评价指标,优选出空白微乳处方,确定了微乳组成成分,即微乳成分为(R)-(+)-苎烯、吐温 80、Transcutol HP 和水,其中吐温 80:Transcutol HP=2:1。优选的LME制备处方:番茄红素和(R)-(+)-苎烯作为载药油相占比8%,吐温 80 和 Transcutol HP(Km=2:1)占比 32%,水含量 60%(w/w)。2.番茄红素微乳特性研究优选处方制备的LME粒径12.61±0.46 nm,PDI值0.086±0.028,Zeta电位-0.49±0.12mV,番茄红素含量463.03±8.96μg/mL,具有良好的物理稳定性。电镜下观察,LME乳滴呈球形,大小较均匀。在连续8w的存放实验中,LME表现出良好的热力学稳定性,在4℃和25℃下,LME存放2、4、6、8w时番茄红素保留率(PLR)显著高于 LOO(Ps<0.05 for2w,PPs<0.01 for4,6and 8 w),结果显示,LME能够更好地保护番茄红素,减少其降解,这种效果在4℃存放时更明显。二、番茄红素微乳体内药代动力学研究LME组和LOO组大鼠灌胃给药后,LME组AUC(4775.93±634.00 h-ng/mL)比 LOO 组 AUC(2270.96±455.46h·ng/mL)显著增高(P<0.01),LME 组Cmax(220.48±30.84 ng/mL)是 LOO 组 Cmax(121.32±13.47 ng/mL)的1.82倍,LME番茄红素相对生物利用度达210.30%,这显示出LME明显提高了番茄红素的口服吸收和生物利用度。LME组t1/2和MRT也显著长于LOO组(Ps<0.05),而CL值则显著降低(P<0.01),结果显示,LME与LOO比较,其降低了番茄红素在体内消除的速度,增加了在血液循环的滞留时间。三、番茄红素微乳体内组织分布与脑靶向研究1.药物在小鼠体内组织分布LME组小鼠血浆、脑、肝、肾、心、肺、脾组织AUC均较LOO组增高,其中以脑组织增高最明显,由LOO组脑组织的416.81 h·ng/g增高至LME组的3549.52h·ng/g;LME组血浆、脑、肝、心和脾组织Cmax与LOO组比较均显著升高(Ps<0.01),尤以脑组织升高最显著,Cmax由LOO组脑组织的20.62±3.39 ng/g升高到LME组的143.86±15.27 ng/g,而两组肾和肺组织Cmax比较无显著性差异(Ps>0.05);t1/2和MRT两项参数,LME组各组织均较LOO组延长,其中脑组织MRT延长幅度最大。实验结果表明,与LOO比较,LME改变了番茄红素在小鼠体内的组织分布,特别是明显提高了药物在脑组织中的分布。2.番茄红素微乳脑靶向性评价口服制剂由于吸收不同而产生血液药物浓度差异,Re和Ce虽不能象静脉用药那样直接评价药物的组织靶向性,但可反映口服药物在组织的分布变化。在各组织中,脑组织Re和Ce值最大,分别为8.52和6.98,表明与LOO相比,LME大幅度提高了药物在脑组织的分布。DTI作为评价药物由血液到组织直接传输的靶向性参数,当DTI>1时,表示具有组织靶向性。肾、心、肺和脾组织DTI值均少于1,未显示LME对该组织具有靶向性,肝组织DTI=1.09,表现出微弱的靶向性,脑组织DTI=3.45,显示LME对脑组织具有良好的靶向性。四、番茄红素微乳对Aβ损伤的神经保护作用研究1.脑组织氧化应激水平Aβ组小鼠脑组织MDA含量较NC组显著升高(P<0.01),Aβ+LME组和Aβ+LOO组MDA含量均较Aβ组显著降低(Ps<0.01),而Aβ+LME组MDA含量也显著低于Aβ+LOO组(P<0.01)。脑组织SOD和CAT活力检测结果显示,Aβ组比NC组显著下降(Ps<0.01),而Aβ+LME组较Aβ组、Aβ+LOO组均显著提高了 SOD和CAT活力(Ps<0.01)。结果表明,LME治疗可显著降低脑组织氧化应激水平,具有Aβ脑损伤保护作用。2.神经炎症反应GFAP和Iba1免疫组织化学结果显示,与NC组小鼠相比,Aβ组小鼠海马和皮层内GFAP和Iba1阳性表达细胞数及阳性分布区域百分率均显著升高(Ps<0.01)。与Aβ组和Aβ+LOO比较,LME灌胃给药显著降低了海马和皮层内GFAP和Iba1阳性表达细胞数和阳性分布区域百分率(Ps<0.01)。与免疫组织化学结果类似,western blotting结果显示Aβ组小鼠脑内GFAP和Ibal表达比NC组显著增高(Ps<0.01),Aβ+LME组与Aβ组比较,GFAP和Ibal的表达显著下降(Ps<0.01),与Aβ+LOO组比较也明显降低(P<0.05,P<0.01)。结果显示,LME有效降低了神经炎症反应。3.脑组织细胞凋亡Western blotting检测结果显示,Aβ组小鼠脑组织Bcl-2蛋白表达水平与NC组相比显著下降(P<0.01),而Bax表达显著增高(P<0.01),Bax/Bcl-2比率明显升高(P<0.01)。与Aβ组、Aβ+LOO组相比,Aβ+LME组Bcl-2表达显著升高(Ps<0.01),而Bax表达明显减弱(Ps<0.01),Bax/Bcl-2比率则显著降低(Ps<0.01)。Caspase-3酶活力检测结果显示,Aβ组小鼠脑内Caspase-3活力显著高于NC组小鼠(P<0.01)。相比于Aβ组和Aβ+LOO组,LME灌胃治疗显著降低了脑内Casβase-3活力(Ps<0.01)。结果表明,LME治疗能减弱Aβ损伤造成的细胞凋亡。4.脑组织Aβ相关代谢与NC组小鼠相比,western blotting检测结果显示,Aβ组小鼠脑内APP和BACE1表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01),ADAM10表达水平显著降低(P<0.01)。与Aβ组比较,Aβ+LME组小鼠脑内APP和BACE1的表达水平显著下降(P<0.05,P<0.01),ADAM10的表达水平显著上升(P<0.01)。APP、BACE1和ADAM10表达水平在Aβ+LME组和Aβ+LOO组之间也存在显著性差异(P<0.05,Ps<0.01)。结果显示,LME对脑组织Aβ相关代谢具有调节作用,可减少脑内Aβ的生成。5.神经元突触可塑性Syn和PSD95 western blotting检测结果显示,Aβ组小鼠脑组织Syn和PSD95表达水平比NC组显著降低(Ps<0.01),与Aβ组、Aβ+LOO组比较,LME灌胃给药显著升高了 Syn和PSD95表达水平(Ps<0.01)。实验结果显示,LME可有效减轻Aβ对神经元突触可塑性的损伤,具有突触可塑性保护作用。研究结论1.通过处方优选,制备的LME性能优良,物理稳定性好,粒径和PDI值小,药物含量较高。在4℃和25℃下连续存放8w,与LOO比较,LME能更好地保护番茄红素,减少其降解。2.体内药代动力学研究表明,与LOO相比,LME明显提高了番茄红素的口服吸收和生物利用度,且降低了番茄红素在体内消除的速度,增加了在血液循环的滞留时间。3.体内组织分布与脑靶向性研究表明,与LOO相比,LME大幅度提高了药物在脑组织的分布,脑组织DTI=3.45,显示LME具有良好的脑靶向性。4.与NC组相比,Aβ组小鼠脑内氧化应激水平显著增高,神经炎症反应增强,细胞凋亡增加,Aβ代谢途径增强、非Aβ代谢途径减弱,突触可塑性降低。与Aβ组相比,Aβ+LME组小鼠脑组织氧化应激水平显著降低,神经炎症反应减弱,细胞凋亡降低,Aβ代谢途径减弱、非Aβ代谢途径增强,突触可塑性升高,且均比Aβ+LOO组显著有效,结果表明LME对Aβ损伤有良好的神经保护作用。研究意义本研究成功研制了口服番茄红素微乳制剂,其具有优良的理化特性,显著提高了番茄红素口服吸收和生物利用度,并具有良好的脑组织靶向性,动物实验证明,其对Aβ损伤有良好的神经保护作用,为AD及其他中枢神经疾病的药物靶向治疗研究提供了实验依据和新的途径,具有实际应用价值和意义。