目的 二价金属离子虽已被证实在控制鲍曼不动杆菌生物膜形成以及病原微生物毒力方面占据重要地位,但是钙影响细菌-细胞相互作用机制尚有待明确。本研究拟探索分析鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞的动态相互作用过程以及钙对鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用的可能影响,并从纳米微观层面对活体生物样本表面进行高分辨探测,为鲍曼不动杆菌定植或感染防控研究提供思路。方法 通过倒置显微镜、实时细胞分析和定量PCR技术观测研究:①鲍曼不动杆菌在不同感染复数、细菌细胞共培养不同时间点以及不同细胞培养状态下对人呼吸道上皮细胞形态与增殖的影响,评价鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞的相互作用,并从中确定合适的细菌感染复数(MOI)以及细菌细胞共培养时间段;②通过改变钙的加入浓度和作用时间分析评价其对鲍曼不动杆菌增殖、相关基因mRNA表达、细菌粘附感染力、人呼吸道上皮细胞形态与增殖以及细菌细胞相互作用(包括细菌生物膜形成、粘附/侵袭细胞等)的可能影响。另外,构建绿色荧光蛋白标记鲍曼不动杆菌菌株,通过扫描离子电导显微镜和激光共聚焦显微镜联用技术实现对呼吸道上皮细胞表面纳米微观层面的高分辨探测和形貌成像。结果①确定细菌细胞共培养4h以及感染复数50:1所对应的细菌浓度用于后续研究。随MOI的增加,鲍曼不动杆菌粘附感染人呼吸道上皮细胞的数量也逐渐增加。鲍曼不动杆菌感染诱发细胞生长指数(CI)升高并伴随之后的下降过程,在感染初期,低浓度的鲍曼不动杆菌对细胞生长可能有刺激作用。随着MOI的减小,到达CI峰值的时间逐渐推迟,且峰值也越高,感染过程中出现独特的“双峰现象”(MOI越小,现象越明显)。②外源性加钙可能对鲍曼不动杆菌的增殖以及人呼吸道上皮细胞的贴壁生长起促进作用,并对鲍曼不动杆菌相关基因mRNA的表达有影响,主要表现为促进abaI、ompA基因mRNA表达,而对bap、carO、bfmR/S基因mRNA表达起抑制作用。另外,钙对鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用有影响,细菌感染细胞时,随培养液中钙浓度的增加,CI上升越快、峰值越高,其刺激生长作用越显著(表现为协同效应),并随着作用时间的推移CI急速下降(钙浓度越大,CI下降越快),感染过程中出现尖锐的“单峰现象”。钙浓度越大、作用时间越长,鲍曼不动杆菌粘附感染人呼吸道上皮细胞的数量就越多。③初步构建了绿色荧光蛋白标记鲍曼不动杆菌菌株(因表达荧光强度弱还需改造优化),成功扫描获得人呼吸道上皮细胞表面纳米微观层面形态图像。结论 钙对鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用有影响,可增加鲍曼不动杆菌对人呼吸道上皮细胞的粘附和侵袭,从而进一步加重细菌对细胞的感染。钙浓度越大(尤其是高钙情况下)、作用时间越长,细胞受细菌粘附感染程度就越严重。由此推测降低或抑制钙浓度对鲍曼不动杆菌定植或感染可以起到防控作用,从而可为多重耐药鲍曼不动杆菌预防及治疗提供新思路。