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研究背景与目的研究背景：氨磷汀全身给药对放射损伤具有显著保护作用已经得到了证明,并已应用至临床。但随着临床的多年应用,发现氨磷汀全身用药给患者带来了诸多不利,如需要专门技术人员进行注射,且低血压发生率高、严重以及还可带来其他临床上难以防治的全身不良反应,因而阻碍了它在临床上的广泛应用。近来,有许多研究报道氨磷汀直肠内给药对减轻放射性直肠损伤有明显作用,并有相应的临床研究予以支持。而对于头颈部恶性肿瘤患者来说,放射治疗是非常重要的治疗方法,但不可避免地会带来放射性损伤,因而如果氨磷汀局部给药是可行且有效的,那么将它用于临床防治头颈部癌症患者因放疗所致的放射性损伤,无疑是给患者和医生带来了新的治疗手段。另外,由于目前文献中报道的氨磷汀及其活性代谢产物WR-1065的检测方法存在许多缺陷,如操作复杂、难以同时直接检测此两种物质、灵敏度低和耗时较久等,因而本实验也旨在建立更为快速、方便、灵敏度更高的检测方法,为今后的科学研究和临床药物监测提供新的方法。目的：1.建立高效液相色谱质谱法(HPLC-MS/MS)检测氨磷汀浓度的检测方法；2.初步探索氨磷汀贴敷于豚鼠颊粘膜这一局部给药方法的可行性；3.初步研究氨磷汀贴敷于豚鼠颊粘膜后对其急性放射性颊黏膜炎保护作用的有效性。方法1.检测方法的建立：收集6位健康成年志愿者唾液,并以其为基质,石杉碱甲(Huperzine-A, Hup A))为内标,采用蛋白沉淀法,用HPLC-MS/MS测定唾液中的氨磷汀。色谱柱为ZIC-HILIC亲水色谱分析柱((100×2.1mm,3.5μm)),质谱分析采用多反应监测扫描模式(MRM),离子源为电喷雾离子源(ESI)。2.可行性的初步研究：收集5位自愿者唾液作为标本,并与氨磷汀配制成浓度为4.5×10-3g/1,9×10-3g/1and18×10-3g/1氨磷汀溶液,静置5、、20、40、60、80、100分钟后检测；选择24只健康成年豚鼠,并将其分成A、B、C三组,A、B组各有9只豚鼠,再分为三个亚组,每个亚组各3只,A、B组豚鼠分别于其每侧颊粘膜贴敷含50mg、100mg的棉片,贴敷时间为30分钟；C组6只豚鼠,为空白对照组；A、B组豚鼠在给药后0分钟、15分钟和30分钟后,应用HPLC-MS/MS检测其血清及颊黏膜组织中的氨磷汀及其活性代谢产物WR-1065的浓度。统计分析采用SPSS17.0软件包。3.有效性的初步研究：选择32只健康成年豚鼠随机分成4组(A、B、C、D),每组8只豚鼠,A、B组豚鼠分别给予氨磷汀50mg和100mg；C组为生理盐水组,A、B、C三组豚鼠给药后均予以单次照射X线30Gy,照射后8天进行肉眼Parkins及Sonis评分,评分后立即分离取出双侧颊粘膜,行HE染色光镜下观察研究；D组为空白对照组。统计分析采用SPSS17.0软件包。结果1.氨磷汀在唾液中检测到的线性范围为0.938～30mg·L-1,线性关系良好,典型代表方程为：y=0.072x+-0.00526(r=0.9991)(n=6),定量下限(Lowest Limit Of Quantification, LLOQ)浓度为0.938mg·L-1,(S/N>10)。唾液样品的低、中、高三个质控浓度(1.0、5.0和25mg·L-1)批内、批间精密度(RSD)均小于15%,其方法回收率均大于85%。2.氨磷汀在人体外唾液中较为稳定,在检测时间内均能保持较高浓度,且各时间点无明显差异(P>0.05),且并未检测到其分解产物WR-1065；在给药后15分钟、30分钟与0分钟相比,豚鼠颊黏膜组织的氨磷汀及WR-1065浓度均显著升高(P<0.05),而给药后15分钟与30分钟相比则无明显差异(P>0.05)。3.B组豚鼠平均得分为2.4分,A组豚鼠平均得分为2.9分,C组豚鼠平均得分为4.4分,D组豚鼠颊粘膜未观察到急性放射性损伤,为正常黏膜,平均得分为0分。A、B两组豚鼠评分经SPSS17.0(SNK法)统计分析比较无统计学差异(P>0.05)；与D组豚鼠相比,A、B、C三组豚鼠急性放射性颊黏膜损伤明显(P<0.05)；A、B组豚鼠与C组相比,则放射性损伤明显减轻(P<0.05)；光镜下观察A、B、C三组豚鼠,均可见炎症细胞浸润(主要是淋巴细胞),其中C组可见大量炎症细胞浸润、血管扩张甚至上皮剥脱、溃疡、坏死、上皮增生等病理变化,A组豚鼠可见部分炎症细胞浸润、毛细血管扩张、上皮结构破坏、脱落、增生等变化,而B组豚鼠较A组豚鼠炎症轻,细胞浸润少以及上皮破坏、增生也较轻。结论1.本研究所建立的氨磷汀检测方法直接、快捷、简便、灵敏度高及定性好,适用于唾液中氨磷汀的测定及科学研究。因而可用HPLC-MS/MS检测生物标本中氨磷汀及其活性代谢产物WR-1065的浓度。2.氨磷汀局部应用于口腔是可行的,且其全身吸收极少,甚或可以忽略；在研究时间点内(5分钟-100分钟),尽管与最初浓度相比有下降,但氨磷汀在人唾液中仍能长时间保持较高浓度；3.局部应用一定剂量氨磷汀于口腔能显著减轻急性放射性口腔颊黏膜损伤,且增加一定剂量,尽管不明显,但组织放射保护作用仍有增强。