人脐带间充质干细胞初始接种密度对成骨诱导分化影响的初步研究目的主要研究人脐带间充质干细胞的体外分离、原代培养,扩增纯化、流式细胞仪细胞表型鉴定,以及对人脐带间充质干细胞初始接种密度对成骨诱导分化影响等生物特性的初步研究,为人脐带间充质干细胞组织工程研究进一步动物实验及临床研究提供理论基础。方法(1)取材无菌条件下取湘雅医院手术室妇产科健康孕妇足月剖腹产脐带组织标本15份,于手术室内无菌条件下解剖去除脐带动静脉,无菌PBS洗去积血,放入事先准备好的培养基送至湘雅医院中心实验室细胞房备用。(2)人脐带间充质干细胞的原代细胞培养、鉴定：在无菌操作台内将准备好的脐带组织剪碎至1mm3组织块,采用Ⅱ型胶原蛋白酶消化法培养原代细胞。待原代细胞培养成功,流式细胞技术鉴定细胞表型。(3)人脐带间充质干细胞传代培养,及其生长曲线绘制。原代细胞培养、并鉴定后,传代培养至第3代时,采用台盼蓝染色记数活细胞数量,记录结果,以时间为横坐标,活细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。(4)不同细胞接种密度人脐带间充质干细胞扩增培养：将第3代细胞以三种不同接种密度(1×105ml,1×106/ml,1×107/ml)进行扩增培养18天,其中每种细胞长满后,记录每组收获细胞总数量及培养时间分别绘制生长曲线。(5)初始接种细胞密度对人脐带间充质干细胞成骨诱导分化的作用研究：将第3代细胞按前述三种接种密度分组接种至细胞培养板进行成骨诱导分化实验,本实验采用成骨诱导培养液含1.0×10-7mol/L地塞米松,50mg/L抗坏血酸,50mg/L维生素C,1.0×10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠及DMEM/高糖培养基。鉴定诱导分化后成骨细胞采用(1)碱性磷酸酶试剂盒染色法。(2)茜红素染色法。所有结果以均数士标准差(X士s)表示,用SPSS.17.0统计软件对实验数据进行分析,组间差异性比较在方差齐性检验后,采用单因素方差分析(ANOVA-LSD)。检验水准为a=0.05,P<0.05认为有统计学意义。结果(1)来源于人脐带Wharton’s jelly胶的单个核细胞经体外培养贴壁后表现为间充质样的细胞,间充质细胞呈成纤维样细胞形态。(2)第3,5,7代细胞生长曲线基本相同。生长共同特性：细胞接种后24小时内贴壁,传代培养潜伏期约为24-36小时；传代培养对数增殖期约为3-5天,在该阶段细胞生长活跃,增势迅速,持续4-5d；对数增殖期结束后4-5天,细胞生长进入平台期。(3)表达间充质干细胞相关的抗原CD 105, CD44,不表达造血干细胞抗原CD34, CD45,与源于骨髓的间充质干细胞一致,只是来源不同。(4)不同初始接种密度人脐带间充质干细胞向成骨诱导分化差异显著(p<0.05),1×106/ml细胞初始接种密度组人脐带间充质干细胞向成骨诱导分化优于其他两密度组。结论人脐带来源的间充质干细胞能在体外培养、扩增,并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型,能够向成骨诱导分化,且最合理的成骨诱导初始接种密度约为1×106/ml。