论文部分内容阅读
慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia ,CML）具有特征性的BCR-ABL融合基因,该基因编码产物p210bcr-abl蛋白具有异常酪氨酸激酶活性,不仅参与髓性细胞恶性转化,还具有免疫原性,能刺激机体产生免疫应答。p210bcr-abl作为目前为数不多的肿瘤特异性抗原之一,它的免疫原性需要深入细致的研究。本实验室已经利用生物信息学软件预测了该蛋白融合区周围包含151氨基酸残基片段的B细胞表位,在此主要分析p210bcr-abl的T细胞表位,并进行鉴定和应用。研究内容分为三部分:一、p210bcr-abl HLA-A*0201限制性T细胞表位预测及初步鉴定由于HLA-A*0201在汉族人群中最为常见,我们选择预测p210bcr-abl中的HLA-A*0201限制性T细胞表位。首先利用生物信息学软件BIMAS、SYFPEITHI预测p210bcr-abl全长及融合区片段中能与HLA-A*0201分子相结合的抗原表位,然后用NetChop3.0分析所选表位被蛋白酶体降解的情况。综合3种生物学软件的预测结果,分别选取了一个融合区内分值最高的表位:SSKALQRPV,及一个融合区外分值最高的表位:LLYKPVDRV。结合国内外的研究基础将融合区内候选表位SSKALQRPV突变为YLKALQRPV,大大提高表位的亲和力。通过T2细胞肽亲和力试验,我们观察到,LLYKPVDRV(被命名为p210bcr-abl642)和YLKALQRPV(被命名为p210bcr-abl926m)两个表位与HLA-A*0201分子均有较高的亲和力。二、CML患者体内两个候选表位特异性CTL细胞的分布收集CML患者的外周血或骨髓,分离单个核细胞,首先标记anti-HLA-A*0201-Alexa 488 mAb,以区分HLA-A*0201阳性或阴性个体;然后再标记PE-肽-HLA-A*0201四聚体（终浓度10μg/ml）和anti-CD8-PE-Cy5 mAb（2μl/105个细胞）,通过流式细胞仪检测双阳性细胞的频率。结果显示:1)20例HLA-A*0201阳性个体中,6例为健康志愿者,14例为CML患者。2)14例HLA-A*0201+CML患者体内均检测到所选两种肽的特异性CTL细胞,通过统计学分析,p210bcr-abl642,p210bcr-abl926m限制性CTL细胞的频率在健康个体和CML患者体内有显著差异（P<0.01）,而流感肽特异性的CTL细胞在两个群体中没有差异（P>0.05）,这说明CML患者体内存在针对bcr-abl642和bcr-abl926m两个表位的特异性CTL细胞,提示这两种肽表位具有免疫原性,可建立基于这两种肽的主动免疫和被动免疫治疗措施。3)对CML患者体内两种表位限制性CTL细胞的分布进行比较,结果显示p210bcr-abl642,p210bcr-abl926m限制性CTL细胞的频率在CML患者体内没有差异（P>0.05）。4)比较不同临床分期CML患者特异性CTL细胞频率的变化情况,结果显示p210bcr-abl642特异性CTL细胞的频率在慢性期病人与加速期病人之间有差异（P=0.03）,提示加速期病人免疫功能急剧下降可能与肿瘤的免疫逃逸机制有关。三、可溶性HLA-A*0201-IgGFc融合蛋白的制备首先抽提人外周血单个核细胞的总mRNA,逆转录成cDNA后,PCR扩增IgG的Fc段基因。将IgGFc基因片段插入载体pFast HTa,形成重组载体pFHT-IgGFc。然后将可溶性HLA-A*0201的基因片段插入重组载体pFHT-IgGFc内IgGFc段的上游,构建重组载体pFHT-HLA-A*0201-IgGFc。将pFHT-HLA-A*0201-IgGFc载体转化DH10Bac大肠杆菌,在转座酶的作用下,HLA-A*0201-IgGFc融合基因插入Bacmid基因组,经蓝白斑筛选,挑取阳性菌落抽提质粒。再将含有目的基因的Bacmid转染昆虫细胞收获杆状病毒上清,感染Sf9细胞获得重组蛋白。融合蛋白经western-blot鉴定其IgGFc片段,经ELISA鉴定其可溶性HLA-A*0201片段。最后通过融合蛋白氨基端的6个组氨酸标签,利用Ni-NTA树脂亲和层析纯化,制备HLA-A*0201-IgGFc融合蛋白。综上所述,本课题首先利用生物学软件预测了p210bcr-abl HLA-A*0201限制性CD8+T淋巴细胞表位,分别选取融合区内外预测分值最高的一个表位,并对融合区内表位进行点突变;对选取的表位进行T2细胞肽亲和力实验,证实所选表位与HLA-A*0201分子具有亲和力。然后制备表位特异性四聚体,检测CML患者体内表位特异性CTL细胞的频率,发现14例HLA-A*0201+ CML患者体内均检测到所选两种肽的特异性CTL细胞,而且p210bcr-abl642特异性CTL细胞的频率在慢性期病人与加速期病人之间有差异;最后利用杆状病毒-昆虫真核表达体系成功表达出HLA-A*0201-IgGFc融合蛋白。本课题不仅为进一步研究抗原表位特异性CTL细胞的表型和功能提供前提条件,还通过初步探讨CML患者的免疫逃逸机制,为开发有效的免疫治疗措施奠定基础。