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研究目的:
1.运用中间丝蛋白Vim标记的胚胎视网膜组织,构建Mnller细胞在视网膜发育过程中的迁移变化,同时了解视网膜不同胚胎发育时期各个层次细胞的演变。
2.运用蛋白质组学技术,建立正常成体视网膜组织与2个月月龄婴儿视网膜组织的二维凝胶图谱,进行质谱分析,比较二者表达的差异。
研究方法:
1.收集25例8~39周胎龄的胎儿眼球标本,5例正常成人眼球标本,进行组织切片,中间丝蛋白Vim抗体孵育,通过常规组织学染色、免疫组织化学和免疫荧光染色,标记不同时期的视网膜组织,普通光镜及激光共聚焦显微镜观察。
2.收集正常成体与2个月月龄婴儿视网膜组织,处理蛋白质样品,二维凝胶电泳,进行凝胶图像扫描分析,选择明显蛋白差异点进行质谱分析。
研究结果:
1.成功再现了视网膜胚胎发育的关键时期(25WG-28WG),Müller细胞作为视网膜的主体骨架结构的形态学演变。人胚8周原始神经母细胞出现’Vim阳性表达;15周在神经节细胞层部分细胞发出杆状阳性突起;19周杆状突起附着于内界膜呈锥状。25~28周Vim在人胚视网膜Müller细胞上的表达上调,25周在视网膜神经节细胞层、内丛状层和内核层出现了长丝状阳性表达;28周附着于内界膜的锥状突起在神经节细胞层部位,与长丝状的阳性表达突起交错排列,部分阳性突起由附着点的内界膜直达外界膜,贯穿视网膜大部分区域,外界膜亦呈阳性反应。
2.正常成体视网膜组织与2个月月龄婴儿的视网膜组织的二维凝胶图谱分别发现735个和780个蛋白点,其中622个点位置相匹配。选取有明显差异的5个蛋白点进行质谱分析,鉴定出以下5种蛋白质,其中人晶体结构A链-血清白蛋白复合体(Chain A,Crystal Structure Of The Ga Module Complexed With Human Serum Albumin)、鸟苷酸激酶1(GUK1protein)在成体视网膜组织中高表达;p2-微管蛋白(Tubulin,beta,2)、醛糖移转酶1(Transaldolase 1)、αA-晶体蛋白(alpha A-crystallin)在2个月月龄婴儿的视网膜组织中高表达。
研究结论:
1.Vim为观察Mü0ler细胞在视网膜发育过程中分化和迁移的一个良好标记物。Vim免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察,能在任意层面获得三维重构图像,适于研究发育过程中的空间构型变化。
2.人视网膜Müller细胞基本发育成熟的时间为胚胎25~28周。
3.运用二维凝胶电泳较容易从不同年龄视网膜组织获取蛋白质差异点。
4.在正常成体视网膜组织中增加了两种蛋白质:人血清白蛋白(Human Serum Albumin)和鸟苷酸激酶1(GUKl protein),这些蛋白质随着年龄的增长,可能与视网膜成熟、结构稳定有关。2个月月龄的婴儿视网膜组织中高表达微管蛋白(tubulin)、转醛醇酶(transaldolase)和晶状体蛋白(crystallin),提示这些蛋白质在发育、抗衰老以及对维持自身内环境的稳定都可能发挥了一定的作用。