半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎。临床上多用于和胃降逆、燥湿化痰、消痞散结等。半夏生品具有强烈的刺激性毒性,误服可导致唇舌刺痛、流涎、咽喉肿胀等,主要表现为对黏膜的强烈刺激性毒性,入内服药必须炮制,经过炮制后其毒性显著降低。主要的炮制品分为清半夏、姜半夏、法半夏三种。课题组前期研究证实,生半夏的刺激性毒性成分为毒针晶及凝集素蛋白。毒针晶具有显著的致炎作用,针晶中带有的毒蛋白为凝集素蛋白,可显著加重毒针晶引起的致炎毒性。课题组的前期研究已阐明采用白矾浸泡的清半夏和采用白矾与生姜共同煎煮炮制的姜半夏的炮制解毒机制,即在炮制过程中,清半夏、姜半夏的辅料白矾中铝离子可络合毒针晶中草酸钙的草酸,使毒针晶晶型结构破坏;白矾及加热煎煮可使凝集素蛋白降解和变性,致使毒性显著降低。生姜中的姜辣素类成分可拮抗凝集素蛋白与受体结合引起的炎症级联反应,从而对机体起到解毒作用。然而,半夏的另一个炮制品——法半夏,其炮制辅料与清半夏、姜半夏完全不同。法半夏是采用pH＞12的石灰水和甘草汁共同浸泡至内外均成黄白色;临床上,法半夏被证明具有明显的燥湿化痰作用,偏于祛寒痰。但到目前为止,法半夏为什么采用石灰水和甘草汁共同浸泡能够降低其毒性?法半夏在临床上具有“燥湿化痰”作用,其物质基础是什么?均未见有深入系统的研究报告。基于此,本文以法半夏为研究对象,深入研究法半夏的炮制解毒机制及与化痰效应相关的物质基础。本论文研究内容分为两部分开展,第一部分:法半夏炮制解毒机制研究。论文建立小鼠腹腔炎症模型和家兔眼刺激模型,以单用甘草汁、石灰水浸泡半夏和甘草汁石灰水共同浸泡半夏,比较炮制后半夏的毒性;同时采用甘草汁浸泡毒针晶、凝集素蛋白,考察甘草汁浸泡对凝集素蛋白和毒针晶的影响,并对甘草汁中起可能具有炮制解毒作用的成分进行研究;同时,以不同pH的石灰水浸泡凝集素蛋白及毒针晶,考察不同pH的石灰水对毒针晶和凝集素蛋白的影响,以期揭示法半夏的炮制解毒机制。第二部分:法半夏化痰效应及相关物质基础研究。论文建立寒饮蕴肺小鼠模型,考察法半夏干预治疗后的作用,采用系统溶剂法分离法半夏水煎液的有效部位,以与痰液生成相关的黏液高分泌指标MUC5AC和水液转运相关的指标AQP5的表达进行化痰效应评价;并进一步采用网络药理学、转录组学技术,采用GO功能、KEGG信号通路分析等探讨与法半夏水煎液化痰作用相关的靶点与作用机制;同时,采用液-质联用技术检测法半夏水煎液入血成分,并与法半夏水煎液中分离得到的效应部位成分进行比对,以期初步明确与法半夏发挥化痰作用相关的物质基础,为法半夏饮片的质量控制、临床安全应用、炮制工艺改革与创新提供科学依据与理论支撑,也为天南星科其他有毒中药研究提供示范和借鉴。研究的主要内容和结果如下:第一部分:法半夏炮制解毒机制研究1.法半夏炮制过程对致炎毒性及毒性成分的影响分别以单用甘草汁浸、石灰水浸及甘草汁石灰水共浸半夏,采用小鼠腹腔炎症模型和家兔眼刺激模型,考察单用甘草汁浸、单用石灰水浸及甘草汁石灰水共浸对半夏致炎毒性的影响。结果表明,生半夏混悬液可致强烈的致炎毒性,单用甘草汁浸、石灰水浸及甘草汁石灰水共浸的半夏,其混悬液致炎毒性均显著降低,尤以甘草汁石灰水共同浸泡半夏的致炎毒性最弱。以Western blot法和扫描电镜考察不同pH石灰水（pH=10、pH=11、pH=12.4）及甘草汁（甘草汁醇沉上清及醇沉沉淀）浸泡对凝集素蛋白含量及毒针晶晶型结构的影响。研究表明,与水浸泡的凝集素蛋白及毒针晶相比,pH＞12的石灰水浸泡可使凝集素蛋白含量显著降低,毒针晶晶型结构破坏;甘草汁及甘草汁醇沉上清浸泡均可使凝集素蛋白含量显著降低,但对毒针晶晶型结构无明显影响。说明,pH＞12是石灰水炮制解毒的关键,甘草汁中的“小分子”类化合物与其炮制解毒有关。上述结果表明,甘草汁与石灰水在炮制过程中可能以协同作用炮制解毒。2.甘草汁炮制解毒机制研究以UPLC-Q-TOF MS/MS技术检测甘草汁中主要成分甘草酸、甘草苷及甘草素在法半夏炮制过程中含量的动态变化;采用Western blot法和扫描电镜考察甘草酸、甘草苷及甘草素溶液浸泡对凝集素蛋白含量和毒针晶晶型结构的影响;同时,以SDS-PAGE法结合银染技术检测甘草汁及甘草酸溶液浸泡凝集素蛋白后上清液与沉淀中的蛋白组成;以MALDI-TOF MS/MS技术检测甘草汁及甘草酸溶液浸泡凝集素蛋白后上清及沉淀中肽段分子量分布,并考察单用甘草汁及甘草酸溶液浸泡对凝集素蛋白等电点的影响;此外,采用透射电镜考察甘草汁与石灰水共同浸泡对凝集素蛋白聚合作用的影响。研究结果显示,在法半夏炮制过程中,浸泡溶液中甘草酸相对含量明显降低,而在浸泡的炮制品中甘草酸相对含量明显升高。与水浸泡凝集素蛋白和毒针晶相比,甘草汁及甘草酸溶液浸泡均可使凝集素蛋白沉淀而含量显著下降,但对毒针晶晶型结构无显著影响。甘草汁石灰水共同浸泡凝集素蛋白后在沉淀中检测到甘草酸,而单用甘草汁及甘草酸溶液浸泡对凝集素蛋白的肽段分子量分布无显著影响,但可使凝集素蛋白的Zeta电位接近于0,达到等电点而沉淀。甘草汁、甘草酸溶液及甘草汁石灰水共同浸泡凝集素蛋白,以透射电镜观察,可见三者均出现大量聚集体,说明,在甘草汁、甘草酸溶液浸泡以及甘草汁石灰水共同浸泡可促使凝集素蛋白形成大分子复合物而沉淀,尤以甘草汁石灰水共同浸泡凝集素蛋白形成的复合物结构最大。上述结果表明,甘草汁中甘草酸是法半夏炮制过程中具有解毒作用的成分之一,可促进凝集素蛋白形成大分子聚合物而沉淀。3.石灰水炮制解毒机制研究以不同pH石灰水、饱和氢氧化钠及碳酸氢钠溶液浸泡凝集素蛋白及毒针晶,采用SDS-PAGE法结合银染技术测定石灰水浸泡凝集素蛋白后上清液与沉淀中的蛋白组成,Western blot技术和扫描电镜考察不同pH石灰水、饱和氢氧化钠及碳酸氢钠溶液浸泡对凝集素蛋白含量和毒针晶晶型结构的影响;同时,以MALDI-TOF MS/MS技术检测不同pH石灰水浸泡凝集素蛋白后上清液及沉淀中肽段分子量分布,圆二色谱检测浸泡过程中凝集素蛋白α-螺旋、β-折叠结构比例变化;分离提取毒针晶基质蛋白,以复合蛋白酶酶解,采用SDS-PAGE结合银染技术及Q Exactive质谱技术检测基质蛋白组成,并检测不同pH石灰水浸泡对毒针晶基质蛋白的影响。进一步采用家兔眼刺激模型,考察结构破坏的凝集素蛋白及毒针晶对家兔眼结膜的刺激性作用。研究表明,与水浸泡的凝集素蛋白相比,pH＞12（pH=12.4）的石灰水浸泡凝集素蛋白后其上清液和沉淀中均未检测到对应的凝集素蛋白条带;以饱和石灰水和饱和氢氧化钠溶液浸泡均可使凝集素蛋白含量显著下降,毒针晶断裂,而饱和碳酸氢钠溶液浸泡对凝集素蛋白含量和毒针晶晶型结构无显著影响;pH＞12的石灰水浸泡可使凝集素蛋白肽段分子量分布及蛋白α-螺旋、β-折叠结构比例发生显著变化,说明凝集素蛋白结构被破坏,而pH＜12的石灰水浸泡对凝集素蛋白肽段分子量分布及蛋白α-螺旋、β-折叠结构无显著影响。复合蛋白酶酶解毒针晶基质蛋白,共检测到3种基质蛋白,分别为18.2 class Ⅰ small shock hsp、ATP synthase subunit beta,chloroplastic 及 EMB1873 protein。其中,18.2 class Ⅰsmallshockhsp属于热休克同源蛋白,占比最高（30.19%）,是与晶体相连的水溶性基质蛋白,与毒针晶的晶型结构维持密切相关,而以pH＞12的石灰水浸泡可使毒针晶断裂,说明石灰水浸泡使毒针晶的基质蛋白结构破坏。以石灰水浸泡后的凝集素蛋白和毒针晶对家兔眼结膜的致炎毒性显著下降;说明,pH＞12的石灰水是法半夏炮制解毒的关键。上述研究结果阐明,法半夏炮制过程中选用石灰水炮制并保持浸液pH＞12,同时加以甘草汁共同进行浸泡,石灰水可使半夏中毒针晶基质蛋白结构破坏,毒针晶晶型结构破坏;使凝集素蛋白原有的α-螺旋、β-折叠比例发生显著变化,凝集素蛋白结构破坏,并发生降解;甘草汁中甘草酸可促使凝集素蛋白形成大分子聚合物而沉淀,甘草汁和石灰水两者协同解毒,使得半夏的毒性极显著下降。第二部分:法半夏化痰效应及相关物质基础研究1.法半夏水煎液化痰效应及有效成分初步分析以卵清蛋白（OVA）和冷水浴刺激诱导建立寒饮蕴肺小鼠体内模型,给予生、法半夏水煎液干预治疗,观察小鼠的一般状况,并测定气道高反应、祛痰作用、肺泡灌洗液（BALF）细胞计数、血清炎性细胞因子、病理变化、肺组织中与痰液生成相关的黏液高分泌黏蛋白MUC5AC和水液转运相关的水通道蛋白AQP5表达以及和mRNA表达变化等;同时,以脂多糖（LPS）诱导的人源支气管上皮细胞（16HBE）体外模型,给予生、法半夏水煎液干预,检测MUC5AC和AQP5的表达,采用UPLC-Q-TOF MS/MS技术对法半夏水煎液的入血成分进行鉴定分析。研究显示,与模型组相比,生、法半夏水煎液高、中剂量干预治疗后,寒饮蕴肺模型小鼠的一般状况、气道高反应性、祛痰作用、BALF细胞数量及血清炎性细胞因子表达、病理变化等均显著改善;体内外模型中的MUC5AC表达水平显著下调,AQP5表达水平显著上调。在法半夏水煎液入血成分中共检测到59个法半夏的原型成分,以有机酸类、生物碱类、黄酮类及氨基酸类等成分为主。其中,54个成分来源于半夏,5个成分来源于甘草。说明,生、法半夏水煎液对寒饮蕴肺模型小鼠具有显著治疗作用,可能与其入血吸收的原型成分有机酸类、生物碱类、黄酮类及氨基酸类等相关,其化痰作用与调节黏液高分泌相关的黏蛋白MUC5AC与调节水液平衡相关的水通道蛋白AQP5的表达水平有关。2.法半夏水煎液化痰效应机制研究以网络药理学方法和转录组测序技术预测法半夏水煎液入血成分的作用靶点及作用机制;同时,以Western blot技术考察法半夏水煎液干预治疗寒饮蕴肺模型小鼠的肺组织对PKC-α/EGFR/MAPK/PI3K-Akt信号通路的影响。研究结果显示,法半夏水煎液入血成分作用于寒痰的靶点共计276个;网络拓扑特征分析可知,十五烷酸、甘草查耳酮A、β-谷甾醇等成分可能与法半夏治疗寒痰效应相关;此外,SRC、MAPK1、MAPK3等作为Hub基因,可能为法半夏治疗寒痰的关键作用靶点;分子对接表明,上述相关的效应物质与关键作用靶点具有较强的亲和力,网络药理学与转录组学的GO功能及KEGG信号通路富集分析结果一致。Western blot实验显示,法半夏水煎液可显著抑制PKC-α、SRC、EGFR、MAPK及PI3K-Akt信号通路的蛋白表达与磷酸化激活。上述研究表明,法半夏水煎液可通过抑制 OVA和冷水浴诱导的PKC/EGFR/MAPK/PI3K-Akt信号通路激活,下调MUC5AC的表达,上调AQP5的表达,发挥化痰效应。3.法半夏水煎液化痰效应物质基础研究为进一步筛选法半夏化痰药效物质基础,论文建立以LPS诱导的16HBE细胞模型,以Western blot法考察法半夏水煎液醇沉上清及醇沉沉淀和不同极性部位干预治疗对MUC5AC及AQP5蛋白表达的的影响,采用UPLC-Q-TOF MS/MS技术对法半夏水煎液有效部位的成分进行检测。研究结果显示,与模型组相比,在一定剂量范围内,法半夏水煎液醇沉上清干预治疗后MUC5AC蛋白表达下调趋势和AQP5表达的上调趋势显著优于其醇沉沉淀,说明法半夏水煎液中的“小分子”类成分化痰效应更强。以提取的二氯甲烷、乙酸乙酯、生物碱与非生物碱部位干预,MUC5AC蛋白表达显著降低,AQP5蛋白表达显著升高;从法半夏水煎液的二氯甲烷部位共鉴定出62种化合物,乙酸乙酯部位共鉴定出54种化合物,两个部位共有成分38种,与水煎液入血成分比较,入血成分占共有成分约60.53%。其中,来源于半夏的入血成分主要有羟基肉桂酸、壬二酸、茴香酸、棕榈酸酰胺、亚油酸、甘油棕榈酸酯、原儿茶醛等,来源于甘草的入血成分主要有甘草苷、甘草查尔酮A、大黄酚等。这些入血吸收的法半夏原型成分可能为法半夏起化痰作用的相关物质基础。本论文系统研究了法半夏的炮制解毒机制和化痰作用相关物质基础,基本阐明法半夏炮制“解毒-存效”的科学内涵:pH＞12的石灰水浸泡可使凝集素蛋白结构破坏,其α-螺旋结构比例从原来的12.6%±0.1%变化为0.1%±0.1%,β-折叠结构比例从原来的43.9%±0.2%变化为80.4%±0.1%,蛋白结构破坏导致凝集素蛋白发生不可逆变性,同时破坏毒针晶的基质蛋白使毒针晶晶型结构破坏;甘草汁中甘草酸可促使凝集素蛋白聚集形成大分子复合物而沉淀,两者协同而解毒。半夏炮制为法半夏后,毒性显著降低,但仍然保留其化痰作用,法半夏中的有机酸类成分,如油酸、亚油酸、亚麻酸等;生物碱类成分,如棕榈酸酰胺、苦参碱、黄豆碱等;氨基酸类等成分,如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等,甘草中的甘草苷、甘草查尔酮A等以原型成分被吸收入血而发挥作用,其作用机制可能为:抑制PKC/EGFR/MAPK/PI3K-Akt信号通路的激活,下调MUC5AC的表达,上调AQP5的表达,从而发挥化痰效应。