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第一部分人体病理性瘢痕组织中成纤维细胞5-hmC阳性表达的研究背景:创伤或手术所引起的病理性瘢痕,会给患者带来极大的痛苦。如何减少或抑制瘢痕的形成,仍然是亟待解决的世界性难题之一。目前临床上减少或抑制瘢痕形成的方法主要有:手术切除,瘢痕内注射,激光治疗,放疗等,但效果都不尽人意。目前,关于瘢痕在分子水平、基因调控和机制方面的研究将有助于改善这些方法,而当前研究较多的基因包括p53,MiRNA-21等。除此之外,表观遗传学中的DNA羟甲基化也是研究热点之一。5-轻甲基胞嚼啶(5-hydroxymethylcytosine5-hmC)是一种重要的表观遗传学标记,它是在DNA轻化酶TET家族(ten-eleven translocation family)的作用下由5-甲基胞嚼啶(5-mc)转化而来的。最近的研究发现5-hmC的缺失与肿瘤的形成、以及某些神经系统疾病有着密不可分的关系,但是尚未有关于病理性瘢痕的研究。因此该研究假设5-hmC的水平是否与病理性瘢痕形成有关,通过探索病理性瘢痕组织中成纤维细胞5-hmC的阳性表达水平与正常皮肤组织比较差异,从基因水平为减少病理性瘢痕形成提供思路。目的:本研究通过收集人体病理性瘢痕组织和正常皮肤组织的标本进行石蜡组织包埋,切片以及染色分析来测定5-hmC在病理性瘢痕组织和正常组织成纤维细胞阳性表达水平的高低,从而判断在病理性瘢痕中成纤维细胞是否存在5-hmC的缺失。方法:本部分研究一共收集7例在哈佛医学院布莱根妇女医院接受瘢痕切除患者的病理性瘢痕组织,年龄范围23-82岁。在研究中,以瘢痕周围的正常皮肤组织作为对照组,研究中所收集的临床标本均来自哈佛医学院布莱根妇女医院皮肤病理研究中心。本研究中,所有使用的标本均取自患者切除的瘢痕组织及部分周围正常组织,所有患者签署知情同意书。切取的瘢痕组织连同周边的正常组织用石蜡做包埋切片染色。分别用于显示组织结构形态的H＆E染色,定性判断瘢痕组织中纤维化形态的Trichrome染色以及测定5-hmC表达的免疫组织化学染色。组织学分析在倒置显微镜下完成。5-hmC 阳性表达的水平由5-hmC 阳性表达的成纤维细胞与同一个视野下的所有成纤维细胞数目的百分比(Percentage)以及其表达强度(Intensity)来计算。所得数据用Graphpadprism 7.0做统计学分析进行比较。结果:H＆E染色和Trichrome染色显示出正常组织与病理性瘢痕组织的不同。免疫组化染色发现,5-hmC在正常皮肤组织成纤维细胞中阳性表达较强,而在病理性瘢痕成纤维细胞中表达较弱甚至缺失。对5-hmC在成纤维细胞阳性表达强度以及百分比进行统计发现,正常皮肤组织中成纤维细胞5-hmC的表达较病理性瘢痕组织强约2.4倍(2.857±0.356 VS 1.143 ±0.971,p<0.001)。结论:与正常组织相比,5-hmC在病理性瘢痕皮肤真皮层中成纤维细胞的表达显著减少。第二部分体外低氧条件下人成纤维细胞5-hmC相关基因表达的探索研究背景:目前的研究发现5-hmC在某些肿瘤组织中的表达显著下降。我们在第一部分的研究中发现5-hmC在病理性瘢痕组织成纤维细胞中的表达同样显著下降。肿瘤组织与病理性瘢痕都是以细胞增生为主的疾病,一些肿瘤相关的基因也在病理性瘢痕组织成纤维细胞中显著表达。已有的研究发现,与肿瘤微环境相似,瘢痕组织中也同样存在缺氧情况,因此该部分研究通过在体外低氧条件下培养成纤维细胞模拟体内瘢痕组织微环境对5-hmC相关基因的表达进行进一步研究。目的:通过对临床标本的研究已经证实病理性瘢痕组织中成纤维细胞的5-hmC的表达显著低于正常组织。本部分实验则旨在模拟瘢痕组织微环境,在低氧条件下体外培养成纤维细胞,对5-hmC及其相关通路基因表达的变化进行进一步研究。方法:在体外培养人皮肤组织来源的成纤维细胞,当细胞数量增长至100%融合时,将低氧试剂二氯化钴(CoCl2)以0,100μM,200μM不同的浓度的以加入培养皿中培养24小时,用Western blot评估低氧因子HIF-1α、FAK、TET3的蛋白表达。用5-hmC antibody-based dot blot来检测5-hmC在低氧环境中的成纤维细胞的DNA表达。用RT-PCR来测定FAK和TET3的mRAN表达。用免疫荧光染色来定性判断5-hmC和FAK的表达。所有检测方法重复3次,数据由Graphpadprism 7.0完成分析。结果:Western blot结果显示,在缺氧状态下,与空白对照组(FBO)相比,CoCl2 100μM 组(FB100),HIF-1α 表达增加(0.825±0.114vs4.60±0.991;p<0.001),CoCl2 200μM 组(FB200)HIF-1α 表达增加(0.825±0.114 vs 7.29±1.119;p<0.001)。与 FB100 相比,FB200组 HIF-1α 表达增强(4.60±0.911 vs 7.29±1.119;p<0.001)。TET3 在正常成纤维细胞中的表达强,而在缺氧之后表达下降(FBO vs FB100:3.367±0.208 vs 1.433±0.058;p<0.001,FBO vs FB200:3.367±0.208vs1.60±0.1;p<0.001)。随着缺氧程度的增加,p-FAK 的表达是增加的(FBOvs FB100:0.703±0.024 vs 1.074±0.009;p<0.001,FB0vs FB200:0.703±0.024 vs1.60±0.017;p<0.001)。RT-PCR 结果显示FAK mRNA的表达随着缺氧程度的增强而增加(FB0vs FB100:1.000±0.0 vs 1.9±0.1;p<0.05,FBOvs FB200:1.000±0.0vs2.267±0.153;p<0.05)。TET3 在缺氧状态下,其表达显著下降(FBOvs FB1OO:1.000±0.0 vs0.633±0.058;p<0.05,FB0vs FB200:1.000±0.0vs0.433±0.058;p<0.05)。Dot-blot 结果显示 5-hmCDNA 随着 缺 氧 浓度 的 增 加 表 达 下 降(FB0vs FB100:20.56±1.25 vs 15.60±1.039;p<0.05,FBOvs FB200:20.56±1.25vs 12.33±0.058;p<0.05)。5-hmC 免疫荧光染色,F-actin＆FAK免疫双荧光染色显示出一致的趋势。结论:病理性瘢痕组织成纤维细胞中5-hmC的表达显著下降,并且5-hmC的减少可能和其信号通路上的TET3表达减少有关。此外,FAK在缺氧环境中的增加,与已有研究瘢痕组织中FAK的表达增加一致。第三部分维生素C提高体外低氧条件下人成纤维细胞5-hmC表达的研究背景:前期的研究发现,不论是病理性瘢痕组织中的成纤维细胞,还是缺氧情况下的成纤维细胞,都存在5-hmC表达下降的现象。已有研究表明Vitamin-C在创面愈合的过程中具有免疫调节,抗氧化,促进血管形成,中性粒细胞趋化以及胶原沉积等功能,而关于Vitamin-C在瘢痕组织中表观遗传学方面的研究甚少。因此,该研究将探索Vitamin-C在缺氧条件培养的成纤维细胞的5-hmC信号通路中是否具有调控作用。目的:本部分研究旨在用Vitamin-C处理低氧干预后的人成纤维细胞,对5-hmC及其相关基因表达情况进行研究,以此评估Vitamin-C对成纤维细胞去甲基化表达的影响。方法:在低氧试剂作用24小时后的培养皿中加入Vitamin-C 100μM,24小时后,用Hif-1α的表达评价细胞缺氧状态,dot-blot测定5-hmC的表达变化。Westem-blot和RT-PCR测定FAK和TET3的表达,所有的测定结果重复3次,由ChemiDOCTM XRS+ With Image Lab曝光显影系统完成印迹测量,数据由Graphpad prism 7.0完成分析。结果:Western blot结果显示,维生素C处理,HIF-1α表达下降(FB1OOvs FB100+VC:4.604±0.911 vs 0.726±0.077;p<0.001;B200vs FB200+VC:7.289±1.119vs3.311±0.468;p<0.001)。TET3 在维生素 C 处理后上升(FBOvs FB0+VC:3.367±0.208 vs 8.15±0.30;p<0.001,FB1OOvs FB100+VC:1.433±0.057vs4.4±0.1;p<0.001;FB200vs FB200+VC:1.6±0.1vs3.12±0.34;p<0.001)。p-FAK 在维生素 C 处理后表达减少(FBOvs FBO+VC:0.703±0.024 vs 1.264±0.076;p<0.05,FB1OOvs FB100+VC:1.074±0.009vs 0.301±0.025;p<0.001;FB200vs FB200+VC:1.599±0.018vs0.316±0.031;p<0.001)。RT-PCR 结果显示TET3 mRNA维生素C处理后,TET3表达上升(FBO vs FBO+VC:1.000±0.0 vs 1.233±0.231;p<0.001,FB1OOvs FB100+VC:0.633±0.057 vs 0.733±0.116;p<0.05;FB200vs FB200+VC:0.433±0.058 vs0.467±0.058;p<0.001。FAK维生素C处理之后,表达显著下降。(FBO vs FBO+VC:1.000±0.0 vs1.62±0.105;p<0.001,FB1OOvs FB100+VC:1.9±0.1vs1.053±0.186;p<0.001)。Dot-blot 结果显示,5-hmC DNA在维生素C处理后,其表达增加(FBO vs FBO+VC:20.56±1.25vs 36.33±3.215;p<0.001,FBlOOvs FB100+VC:15.6±1.039vs27.67±2.082;p<0.001)。除了 FB200 缺氧组,在经历维生素C处理后,其5-hmC DNA表达增加并无明显统计学意义(FB200vs FB200+VC:12.33±0.578 vs13.42±0.947;p>0.05)。5-hmC免疫荧光染色,F-actin＆FAK免疫双荧光染色显示出一致的趋势。结论:Vitamin-C能够部分提高低氧环境中成纤维细胞5-hmC和TET3的表达,并且能够部分逆转细胞的缺氧状态,使促进瘢痕形成的FAK的表达下降,为一定程度上用Vitamin-C抑制瘢痕形成提供了新的思路