论文部分内容阅读
目的：1.选择合适的葡萄糖与皮质酮干预浓度,建立DD细胞模型,从细胞功能形态学、葡萄糖消耗量、单胺递质及神经再生相关指标等不同维度确立模型评价体系,为DD的实验研究奠定基础。2.以所建DD模型细胞为研究对象,给予中药复方左归降糖解郁方干预,明确其降糖和抗抑郁作用,并初探其治疗DD的作用机理,为DD的防治提供新思路和新方法。方法：1.DD细胞模型的建立。(1)DD细胞模型诱导剂的选择。离体培养原代海马神经元细胞7d,按诱导剂浓度不同随机分为9组。通过细胞存活率选择最佳的葡萄糖与皮质酮干预浓度组合。(2)DD细胞模型的建立。按照(1)获得的诱导剂最佳浓度组合,建立DD细胞模型。按诱导剂随机分为4组：正常组(不做任何处理)；葡萄糖组(75mM/L葡萄糖干预)；皮质酮组(100-/L皮质酮干预)；葡萄糖联合皮质酮组(75mM/L葡萄糖联合100μM/L皮质酮干预)。诱导剂干预24h后,①功能形态学评价：神经细胞鉴定, MTT测定细胞存活率,TUNEL染色测定凋亡小体；②葡萄糖消耗量：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测海马神经元细胞葡萄糖消耗值；③单胺递质：ELISA法测定神经递质5-HT、NE、DA;④神经再生：免疫细胞化学法检测各组海马神经元细胞神经营养因子CREB和BDNF的含量。2.左归降糖解郁方的干预作用。采用方法1确定的DD建模方法复制细胞模型,并随机分为4组：正常组,模型组,模型模型+(二甲双胍+百忧解)含药血浆组,模型+左归降糖解郁方含药血浆组。药物干预24h,各组海马神经元细胞按照方法1指标进行检测。结果：1.(1)与正常组比较,浓度组合七(75mM/L葡萄糖联合100μM/L皮质酮)在各个对应时间点细胞存活率下降显著且平稳。(2)与正常组比较,葡萄糖(75mM/L)联合皮质酮(100μM/L)干预组海马神经元细胞存活率显著下降(P<0.01)；凋亡小体数量明显增加；葡萄糖消耗值明显下降(P<0.01)；神经递质5-HT含量显著下降(P<0.01)；细胞内神经营养因子BDNF和CREB含量明显降低(P<0.05)。2.与正常组比较,模型组海马神经元细胞各项指标均出现明显异常。与模型组比较,左归降糖解郁方含药血浆组海马神经元细胞存活率在第24h后明显上升(P<0.05)；凋亡小体数量明显下降；葡萄糖消耗值在第12h后显著上升(P<0.01)；细胞内神经递质5-HT含量显著上升(P<0.01)；细胞内神经营养因BDNF子和CREB含量明显升高(P<0.05)；关键蛋白NR2A表达下降、NR2B表达明显增加(P<0.01)。结论：1.结合文献调研与实验结果,选择75mM/L葡萄糖联合100μM/L皮质酮作为最佳的葡萄糖与皮质酮浓度干预组合。2.结合DD的临床特征,采用GOD-POD法检测葡萄糖消耗量,神经递质三项,神经营养因子等5项11个指标建立一套糖尿病并发抑郁症细胞模型的评价体系。3.采用葡萄糖(75mM/L)联合皮质酮(100pM/L)干预成熟原代海马神经元24个小时的复合造模方法成功制备DD细胞模型。4.糖尿病并发抑郁症海马神经元细胞病理损伤严重,神经递质分泌紊乱,异常升高的CORT含量导致细胞病理改变,细胞内神经营养因子BDNF和CREB表达下调可能协同参与CORT损伤细胞过程,并促进了DD的发生发展。5.左归降糖解郁方可升高海马神经元细胞存活率,降低凋亡小体数量,调节葡萄糖消耗量,改善细胞神经递质分泌紊乱,增加神经营养因子蛋白表达等,其治疗作用可能与升高细胞内NR2A和NR2B表达有关,具有一定的疗效,值得进一步研究和开发。