研究背景及目的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的致残率在世界范围内居于首位,据美国的一项调查显示,脊髓损伤这一残酷性的疾病,呈高发病率、高致残率、高耗费、低死亡率的特点,给患者和社会带来极大的痛苦和负担。最近研究显示即使很小的脊髓损伤也将会给患者带来巨大的灾难,而轻微的修复也将会大大改善患者的生活质量。有学者提出我们的目标也许不是完全修复脊髓损伤,而是让患者能够站起来,生活自理。查阅国内外文献,脊髓损伤的治疗早已成为世界各国学者研究的热点,近年来骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)移植成为脊髓损伤治疗的焦点。尤其是BMSCs能够取材于成人自身的骨髓,避免了胚胎干细胞和神经干细胞所带来的伦理学和免疫学排斥问题,并且容易增殖。这些优点使得BMSCs移植已经成为极有前景的移植材料,况且其可以促进脊髓损伤的修复已无异议。BMSCs的发现及其相关研究为脊髓损伤提供了一种新的治疗方法,BMSCs移植这一治疗手段的目的是通过移植的BMSCs来修复、重建受损的脊髓的功能。前期的有关BMSCs的动物实验已经为进一步的临床研究打下了基础。目前,国内外已有BMSCs移植治疗脊髓损伤的临床研究报道。美国部分学者对接受BMSCs移植治疗的脊髓损伤患者进行细胞移植前后评分,完全按照美国脊髓损伤协会标准进行功能、运动、轻触觉、针刺觉评分,差异均有显著性意义(P<0.00001)。BMSCs移植后无严重并发症,这提示BMSCs移植可以作为急性脊髓损伤的一种治疗手段。目前治疗观念业已发生转变——轻微的修复可以极大改善病人的生活质量,也将更加促进该领域的进一步研究。然而,移植BMSCs修复损伤的脊髓仍然有些问题需要解决,比如：脊髓损伤的生物机制,尤其是损伤后神经元凋亡的机制以及轴突再生的机制；BMSCs修复脊髓损伤的疗效尚不肯定,促进脊髓再生和修复的机制不清楚；如何确定细胞移植的时机、方法、剂量；如何预防术后发生免疫排斥反应、椎管内感染等并发症；神经元再生或者神经轴突再生后的非侵入性磁共振显像或者示踪；如何把神经营养因子通过模拟的细胞外基质或者是转染的细胞导入缺损处。其中,如何将BMSCs最有效地移植到脊髓的损伤处已成为国内外研究的核心问题。目前,国内外学者将BMSCs移植到损伤的脊髓处常用的途径有静脉注射、蛛网膜下腔注射和局部注射三种途径。然而,这三种途径各有优缺点：A：静脉注射,该途径显然能避免很多不必要的损伤,但是细胞注射到血液中,只有很少一部分能迁移到脊髓内,到达损伤局部的更是微乎其微,这将难以取得理想的治疗效果。B：蛛网膜下腔注射,凭借脑脊液直接与脊髓接触,经此途径注射BMSCs虽然可以,但是对于高位脊髓损伤患者来说,该途径手术危险性大,并发症多,临床上难以开展。C：损伤部位直接注射,该方法能够将BMSCs毫无损失地移植到脊髓内,但是需要在脊髓损伤后再次暴露脊髓,增加了感染和出血的机率。更严重的是,重新剪开已经愈合的皮肤和肌肉,并在损伤原位进行注射,所有这些操作将导致脊髓损伤进一步的加重,而且无法控制个体之间处理上的差异,增加了对结果的干扰因素,对于临床应用来说手术创伤大,对患者功能的恢复造成第二次损害。所以,对于BMSCs移植修复脊髓损伤目前仍需要探索出更合理有效的方法。研究对象与方法1研究对象：健康家兔36只,活动正常,毛发光亮,个体质量为2.0-2.5kg,平均2.3kg,雌雄不限(由南方医院动物实验中心提供)2研究方法：①BMSCs的提取：麻醉处死备用家兔2只,取其股骨及胫骨备用。注射器冲洗备用的股骨及胫骨得到单细胞悬液,用DMEM液冲洗该细胞悬液去除骨碎片。把全骨髓细胞与青霉素-链霉素及小牛血清混合在一起制成样本,把该样本离心后得到BMSCs团。体外培养至第3代后用家兔CD49；CD106及CD45,流式细胞仪鉴定后备用。②BMSCs的绿色荧光与菲立磁标记以及稳定株的筛选：构建表达绿色荧光蛋白基因的腺病毒。转染时用20μL Lipofectamine2000按说明转染BMSCs,用流式细胞仪筛选出稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。胞培养7d后行Feridex标记,细胞内铁的鉴定用普鲁士蓝染色法。③脊髓损伤模型的建立及BMSCs的移植：腹腔注射麻醉动物,在T5-T7节段切除椎板及黄韧带,显露硬脊膜,用SS-Ⅱ型脊髓打击器,制作成组间一致,局部不完全脊髓损伤,实验组模型制作完成后,通过临近肋间后动脉注射入已经离心好的BMSCs,对照组只制成脊髓损伤模型。④全脊髓MRI扫描：第4d、14d,水合氯醛麻醉动物,安装上家兔3英寸表面线圈,用MRI机,扫描全脊髓。T2加权像,收集3.0T的磁场强度磁共振信号。⑤组织切片荧光显微镜以及透射电镜检查：不同时间节段各组麻醉动物各2只,以质量分数4%多聚甲醛1000ml经心脏灌注固定,完整地切取伤区脊髓,低温条件下切成14μm厚度冰冻切片,重新漂洗,盖上盖玻片,行荧光显微镜检查；同时间麻醉处死所有动物,完整切取伤区脊髓组织,超薄切片机切片(50nm)电镜观察。⑥神经电生理检查：第2d、7d、14d,对实验对象行肌电图-诱发电位仪电生理检测,先行运动诱发电位检测,刺激电极为针电极,记录电极置于家兔下肢胫前肌,参考电极置于足垫部,采用触发方式,不做平均,记录下运动诱发电位的潜伏期和波幅。3、观察指标：①BMSCs的原代培养及流式细胞仪鉴定结果②BNSCs的菲立磁以及GFP标记鉴定结果③实验组脊髓组织病理切片宏观观察结果④全脊髓MRI扫描结果⑤脊髓损伤处显微镜以及电镜观察结果⑥双下肢神经电生理检查结果4、统计学处理记录神经电生理结果,包括诱发电位的潜伏期及波幅,并绘制成表格,应用SPSS13.0统计学软件,数据用x±s表示,组间比较用两独立样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。结果①BMSCs的体外培养及流式细胞仪鉴定结果BMSCs原代培养第5d,细胞呈梭形类似成纤维细胞,肉眼难以与成纤维细胞鉴别。流式细胞仪鉴定结果显示该细胞高表达CD29、CD106,不表达CD45所对应的抗原。②实验组脊髓组织病理切片宏观观察结果离心后的BMSCs被菲立磁染成铁锈色,实验14d时脊髓标本肉眼外观,可以看到被染成铁锈色的脊髓组织,对照组脊髓组织切片未见该铁锈色变化。③全脊髓MRI扫描结果第4d磁共振检查,T2WI相,脊髓损伤原高信号区域显示来自于菲立磁标记的BMSCs低信号改变,信号强度较弱。同期对照组未见类似低信号改变,局部水肿导致的高信号扩大。第14d磁共振检查,T2WI相,脊髓损伤区域显示较强来自于BMSCs的低信号,狭窄低信号通过脊髓损伤区域。同一时间对照组水肿减轻,未见类似低信号改变。④显微镜及透射电镜观察结果第4d荧光显微镜检查,脊髓组织切片的冠状面及矢状面皆有细胞表达绿色荧光蛋白,但荧光强度较弱。第14d再次行荧光显微镜检查,脊髓组织切片的冠状面及矢状面荧光强度皆增强。第14d行透射电镜检查,实验组脊髓有新生髓鞘,部分髓鞘内有细铁颗粒,而对照组未见新生髓鞘形成,轴突脱髓鞘化严重,神经元变性明显。进一步放大新生髓鞘,新生髓鞘板层致密,与轴索之间无缝隙,轴索结构完整,神经元细胞核染色均匀、清晰。⑤神经电生理检查结果第14d行神经电生理检查,两组间动作诱发电位潜伏期及波幅均存在差异,实验组潜伏期较短,波幅较大,差异有统计学意义(P<0.05,表1,2)。结论本实验第4d,对实验组行MRI检查,在T2WI相,脊髓损伤处高信号区域显示来自于菲立磁标记的BMSCs(?)低信号改变；对脊髓损伤处行荧光显微镜检查,脊髓组织切片的冠状面及矢状面皆有细胞表达绿色荧光蛋白,证明BMSCs已经迁移到损伤处,并且存活。第14d再次行磁共振检查,在T2WI相,脊髓损伤区域显示较强来自于BMSCs的低信号,狭窄低信号通过脊髓损伤区域；同时间行荧光显微镜检查,脊髓组织切片的冠状面及矢状面荧光强度皆增强,表示BMSCs开始增殖,进一步向脊髓损伤区域集中。第14d,取出脊髓标本肉眼观察外观情况,可看到在脊髓损伤处的瘢痕组织内有被染成铁锈色的脊髓组织,进一步行透射电镜检查显示脊髓有新生髓鞘,部分髓鞘内有细铁颗粒。第14d,实验组与对照组家兔动作电位潜伏期及幅度的差异开始有统计学意义。这与国内外学者的研究结果相符,说明BMSCs对脊髓损伤后神经传导功能的恢复具有潜在的临床意义。实验证明通过肋间后动脉注射BMSCs可以到达并且聚集在T7节段。实验组脊髓的宏观观察发现被染成铁锈色的BMSCs集中在受损伤的脊髓的背侧,并且通过绿色荧光显微镜证明该事实。所有这些结果都证明通过肋间后动脉介入注射的BMSCs可以集中于受伤的脊髓处。因为提取脊髓的数量有限并且细胞培养需要一段时间,异体BMSCs移植数量是微小的,所以,BMSCs可以在脊髓损伤处自动聚集就显得非常有意义。