羊痘是由羊痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,是所有动物痘病中最为重要的一种。由该病毒引起的疾病在1997年被世界动物卫生组织(OIE)列为93种必须报告的动物疫病之一,我国也将其列为一类动物疾病。羊痘病毒P32蛋白是位于羊痘病毒囊膜表面的主要结构蛋白,含有主要的抗原表位。CD58即淋巴细胞功能相关抗原-3,与CD2结合既可使免疫系统处于激活状态。本文旨在将羊痘病毒抗原基因和CD58基因构建在同一载体上,发挥CD58的免疫佐剂作用,以增强表达P32蛋白的免疫效果,为进一步开发高效的DNA疫苗奠定基础。本实验从健康的羊的血液中分离淋巴细胞,用RT-PCR扩增羊致敏淋巴细胞中的CD58基因,将CD58基因插入pGEX-4T-1载体,构建了能够表达CD58的原核表达载体pGEX-CD58。经ITPG诱导,目的基因在大肠杆菌中得到表达,表达蛋白质分子量为53ku。经鉴定能与羊CD58的单克隆抗体发生反应,说明表达产物具有反应原性。从羊痘组织病变中扩增得到P32基因,与pBudCE4.1载体连接,构建的质粒pBudCE4.1 /P32 ,与此前获得的CD58基因共同构建重组质粒pBudCE4.1/CD58/P32。质粒提纯后,在脂质体作用下转染BHK-21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别检测P32和CD58在BHK-21中的表达。结果显示,P32和CD58在BHK-21细胞中都得到表达。以BALB/c小鼠为动物模型,通过肌肉注射接种免疫BALB/c小鼠,定期采血用ELISA法检测免疫抗体水平;用MTT法检测细胞免疫情况,结果表明,共表达载体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。