呼吸道细菌感染是临床常见病、多发病,随着疾病谱的改变、治疗新技术的运用和经验用药,导致条件致病菌引起的呼吸道感染增多、细菌谱变化和对抗生素耐药性不断增高。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)是呼吸道感染和院内感染的常见致病菌,近年来,随着碳青霉烯类抗生素的大量使用,产生了对美罗培南或亚胺培南耐药的肠杆菌。而肺炎克雷伯菌一旦产生碳青酶烯酶(Klebsiella pneumoniae Carbapenemase, KPC)几乎可以对所有β-内酰胺酶类抗生素产生耐药作用。本课题对上海市某肺部专科医院呼吸道感染细菌谱、耐药谱和临床特征进行调查,着重了解克雷伯菌感染所致肺炎的流行现状、抗生素耐药情况及分子生物学特征,探索KPC耐药菌传播的危险因素和分子生物学机制,为临床进一步有效控制KPC耐药菌传播提供科学依据。本研究共分为以下三个部分：第一部分住院患者呼吸道细菌感染流行病学研究目的调查上海市某肺部专科医院住院患者呼吸道细菌感染谱、临床特点、耐药情况及可疑危险因素分布,为有效控制住院患者呼吸道细菌感染提供依据。方法以连续三个月内入住该院呼吸内科和胸外科的因疑似呼吸道感染而送检痰普培标本的病人为研究对象开展横断面调查,通过细菌培养、耐药检测、病史记录查询和问卷调查等方式,了解住院患者呼吸道细菌性感染阳性率、细菌谱和耐药分布,分析影响住院患者发生呼吸道细菌感染的主要危险因素。结果研究共识别合格对象1865例,其中完成痰标本收集的患者为1290例,从中分离到呼吸道感染细菌菌株249株,细菌感染阳性率为19.30%。患者呼吸道细菌感染的分布依次为：肺炎克雷伯菌137例(55.0%),铜绿假单伯菌30例(12.0%),鲍曼不动菌30例(12.0%),阴沟肠杆菌15例(6.0%),大肠埃希菌8例(3.2%)和金黄色葡萄球菌1例,此外还有其它细菌感染28例(11.2%)。249例感染患者中科室分布情况,结核科29例(9.6%)、尘肺科31例(18.8%)、呼吸科21例(7.0%)、肿瘤科65例(14.8%)、胸外科(监护室)101例(15.3%),各科室的致病菌感染存在统计学差异(Χ2=70.347,p=0.000),在各科室中,尘肺科的检出率最高,其次是胸外科和肿瘤科；致病菌感染年龄分布情况,<40岁21例(8.2%)、40～岁26例(10.3%)、50～岁72例(13.3%)、60～岁67例(12.8%),至70岁61例(21.6%),各年龄段致病菌检出率存在着统计学差异(Χ2=17.634,p=0.001),随年龄的增长而提高,≥70岁的老年病人最高；不同就业状态致病菌分布情况：退休阳性172例(22.9%)、在职68例(14.4%)、待业4例(8.2%),不同就业状态的对象致病菌感染构成比不同,退休的患者感染高于在职和待业的患者(Χ2=18.060,p=0.000)；男性178例(14.5%),女性69例(10.8%)男性与女性致病菌感染未见统计学显著差异(Χ2=2.784,p=0.095)；测定249株细菌对16种抗菌药物的敏感性,130株肺炎克雷伯氏菌敏感性>80%的为氨苄西林/舒巴坦(86.9%)、阿米卡星(93.4%)、氨曲南(89.8%)、环丙沙星(92.7%)、头孢曲松(89.1%)、头孢唑林(83.9%)、厄他培南(93.4%)、头孢匹美(89.1%)、庆大霉素(91.2%)、亚胺培南(92.0%)、左氧氟沙星(92.0%)、复方新诺明(85.4%)、头孢他啶(88.3%)、妥布霉素(92.0%),耐药率>80%的为氨苄西林(90.5%)：30株铜绿假单胞菌敏感性>80%的为阿米卡星(100%)、氨曲南(100%)、环丙沙星(96.7%)、头孢匹美(96.7%)、庆大霉素(100%)、亚胺培南(93.3%)、左氧氟沙星(90%)、头孢他啶(100%)、妥布霉素(100%),耐药率>80%的为氨苄西林(100%)、氨苄西林/舒巴坦(100%)、头孢唑林(96.7%)、呋喃妥因(100%)、复方新诺明(100%),30株孢曼不动菌敏感性>80%的为氨苄西林/舒巴坦(86.7%)、阿米卡星(96.7%)、环丙沙星(83.3%)、头孢匹美(86.7%)、庆大霉素(83.3%)、亚胺培南(86.7%)、左氧氟沙星(86.7%)、复方新诺明(80%)、头孢他啶(86.7%)、妥布霉素(90%),耐药率>80%的为氨苄西林(96.7%)、头孢曲松(96.7%)、头孢唑林(96.7%)、呋喃妥因(96.7%)。进一步分析呼吸道细菌感染病例的临床特征,患者在入院前抗生素的使用情况：不同性别之间无统计学显著差异(Χ2=4.934,p=0.294)；不同年龄组有统计学差异(Χ2=26.734,p=0.045),其中50～岁使用1种和≥3种抗生素最多,分别为37.8%和38.9%、60～岁使用2种抗生素最多占29.8%；不同病区有统计学差异(Χ2=307.76,p=0.000),使用1种抗生素依次为呼吸科(31.6%)、肿瘤科(27.6%)、胸外科ICU(21.4%)、结核科(19.4%)、尘肺科(0),使用2种抗生素依次为呼吸科(51.9%)、结核科(19.2%)肿瘤科(15.4%)、胸外科ICU(13.5%)、尘肺科(0),使用≥3种抗生素依次为呼吸科(38.9%)、结核科(29.2%)肿瘤科(26.4%)、胸外科ICU(5.6%)、尘肺科(0),抗生素使用呼吸科最高,尘肺科均没用；影响住院病人肺部细菌性感染相关的危险因素,单因素分析：各年龄段细菌性感染有统计学意义(Χ2=17.634,p=0.001)依次为50～岁(29.1%)、60～岁(27.1%)、≥70岁(24.7%)、40～岁(10.5%)、<40岁(8.5%)；性别和入院前住院次数无统计学显著差异；住院前临床特征分析：有肺叶切除史、气管镜操作史、肺穿刺史、激素使用史、胸腔插管史、放化疗史和糖尿病史对细菌感染均无统计学显著差异；入院后肺部手术(z2=6.259,p=0.012)、气管镜检查(Χ2=6.707,p=0.010)、呼吸机使用(Χ2=8.537,p=0.003)对呼吸道感染有统计学差异,气管插管、胸腔插管和肺穿刺无统计学显著差异。结论上海市某肺部专科医院住院患者送检痰标本细菌检出阳性率19.30%,其中革兰氏阴性菌检出率>80%,高于文献报道。249例感染患者尘肺科的检出率最高,呼吸科最低。130株肺炎克雷伯氏菌对大多数抗菌药物敏感,对氨苄西林耐药率为90.5%；30株铜绿假单胞菌对多数抗菌药物敏感,对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林均完全耐药；30株孢曼不动菌对氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林耐药。所以,在经验性使用抗菌药物时,应尽量避免使用以上耐药率较高的抗生素。不同病区使用抗生素有统计学意义,呼吸科最高,尘肺科均没用,结合致病菌的感染情况,早期合理使用抗生素对控制细菌感染有帮助。入院后肺部手术、气管镜检查、呼吸机使用对呼吸道感染有统计学意义,说明入院后的侵入性操作和治疗容易引起呼吸道感染,所以应做好设备的消毒和灭菌。气管插管、胸腔插管和肺穿刺无统计学差异,提示应尽可能使用一次性的医疗器械,可以避免人群间的交叉感染。第二部分肺炎克雷伯氏菌耐药相关基因特征研究目的研究上海市某肺部专科医院肺炎克雷伯氏菌抗生素的易感性和由广谱β内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶质粒介导的基因分型。方法连续三个月从检验科收集的211例肺炎克雷伯氏菌阳性标本。通过微扫描MIC方法检测细菌抗生素的敏感性,用PCR扩增与DNA纯化分离对ESBLs和AmpC酶作表型鉴定。结果在所研究的211株肺炎克雷伯氏菌中,经表型试验确认有78株产ESBLs,产ESBLs菌对氨苄西林全部耐药,而非产ESBLs菌对氨苄西林耐药率为77.4%,二者相比差异有统计学意义(p=0.0001)。产ESBLs菌对氨曲南和头孢他啶的耐药率分别为20.5%和15.4%,与非产ESBLs菌(0.8%和1.5%)相比,差异有统计学意义(p<0.05)。产AmpC酶菌株对头孢他啶、氨曲南、环丙沙星和阿米卡星敏感性明显降低(p<0.05)。CTX-M型超广谱β-内酰胺酶阳性菌株基因型均为CTX-M-3。比较不同ESBLs耐药相关基因型对抗生素的耐药率。所有SHV阳性菌株对氨苄西林耐药,明显高于SHV阴性菌株,差别有统计学意义(100%.vs.75%,Χ2=26.52,p=0.0001)。TEM阳性菌株对头孢他啶的耐药率要明显高TEM阴性菌株(10.3%.vs.2.4%,X2=4.19,p=0.041), CTX阳性菌株对头孢他啶(13.5%.vs.4.0%,Χ2=5.12,p=0.024)和氨曲南(16.2%.vs.4.6%,Χ2=6.65,p=0.001)耐药率要高于CTX阴性菌株,差别有统计学意义。结论本地区肺炎克雷伯氏菌产ESBLs状况已很严重。研究显示该院临床分离的肺炎克雷伯菌主要存在SHV-1型和TEM型ESBLs流行。通过检测肺炎克雷伯氏菌ESBLs基因和产ESBLs酶,以及ampC基因和产AmpC酶,可为临床医师的合理用药提供一定指导。第三部分肺炎克雷伯氏菌基因分型及流行特征研究目的研究上海市某肺部专科医院住院患者呼吸道肺炎克雷伯氏菌基因分型及与临床耐药的关系。方法通过抗生素敏感试验,PCR扩增、MLST分析网络(www.mist.net)进行分析。结果对211株KP菌株进行MLST分析,有94种不同的序列型。通过eBURST分析,发现所识别的60种ST型可以进一步组成三种主要的克隆系(clonal complex)和10种单一型(singletons)。分析不同克隆系对抗生素药物的敏感情况结果发现,除CC259克隆系外,其他克隆系及独株普遍对氨苄西林有较高的耐药比例,统计学检验无明显差异。CC5021克隆和CC340克隆对头孢他啶耐药率分别为11.1%和10%,明显高于其他克隆系菌株和独株,且差别有统计学意义(p<0.05)。所有克隆系和独株对氨曲南的耐药率在10%左右。另外,CC340克隆系对于环丙沙星和阿米卡星的耐药率分别为13.3%和16.7%,明显高于其他克隆系菌株和独株(p<0.05)。进一步分析不同克隆系中耐药相关基因分布,结果发现在不同克隆系中SHV-1型基因阳性的比例相当,在39.7%～42.1%不等,差别无统计学意义。CC5021和CC340克隆系中TEM、CTX-M型基因阳性比例分别为74.1%和70%,且明显高于其他克隆系菌株和独株(p<0.05)。通过单因素和多因素分析,结果发现,主要流行菌株感染患者中更有可能是来自呼吸科(25%.vs.15%,OR=1.25；95%CI：1.018～3.624)。同时感染主要流行菌株患者的住院天数要明显高于感染其他菌株的患者(OR=1.03；95%CI：1.020～2.340)。同时肺部感染是送检主要流行菌株最主要的原因(OR=1.67：95%CI：1.118～4.578)。结论本院流行的KP菌株与全球流行菌株有一定的遗传相关性。医院及周围的地区存在某些KP克隆系的地方性流行。ST258型被认为是引起碳青霉烯酶耐药全球流行的主要菌群。对于感染ST11序列型KP株的患者即使识别和治疗有助于更好地控制抑制碳青霉烯类药物耐药菌株在人群间的流行。blaCTX-M/blaTEM阳性KP菌对于头孢菌素类抗生素耐药性较高,主要流行株具有较强的传播力,但毒力与其他菌株相当。有必要在临床和治疗过程中监测这些主要流行菌株及耐药决定因素。