研究背景糖尿病是一种病因复杂的慢性代谢紊乱性疾病,目前全世界患病人口约4.63亿(https://www.idf.org/)。由于人口老龄化和生活方式的改变,在未来几十年受此疾病影响的人数将进一步增加,预计到2040年将超过6亿。鉴于其高发病率和反复的并发症,糖尿病治疗已成为一项重大的公共卫生挑战。肝脏是调节血糖浓度的主要器官,肝葡萄输出和存储异常是2型糖尿病(T2DM)患者高血糖的主要原因,主要表现为糖酵解、糖原合成能力降低,糖异生增加。T2DM主要发病核心为胰岛β细胞功能减退和胰岛素抵抗。β细胞功能的衰竭主要归因于β细胞数量和质量的下降。传统观点认为β细胞数量的减少是细胞过早凋亡的结果,且早期研究工作主要集中在增加β细胞存活上。但最近多项研究对β细胞凋亡假说发起了挑战。这些数据表明,β细胞去分化是一种解释功能性β细胞丧失的新机制。在去分化过程中,β细胞不发生凋亡,而是随着关键β细胞标志物(比如如胰-十二指肠同源框-1[PDX1]、插头蛋白转录因子01[FOXO1]、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A[MAFA])表达的减少而丧失原有成熟β细胞的身份,转变为表达神经元素3(NGN3)和八聚体结合蛋白-4(OCT4))等转录因子的内分泌前体细胞,进一步致使β细胞数量、胰岛素分泌减少。因此,改善肝糖代谢、抑制胰岛β细胞数量和功能的下降是治疗T2DM十分重要的策略。干细胞是一种可以进行自我更新并分化为多种类型的细胞,主要分为三种类型:胚胎干细胞(ESCs),成年干细胞(ASCs)和诱导性多能干细胞(iPSCs)。间充质干细胞(MSCs)属于具有多向分化潜能的ASCs。MSCs可以来源于几乎所有类型的组织,包括骨髓、脐带、脂肪组织、骨骼肌组织、肝组织和血液等。近些年,MSCs在基于细胞治疗中的功效和安全性引起了极大的关注,它避免了ESCs和iPSCs的伦理和致癌风险,是目前T2DM细胞治疗中研究最多的细胞。骨髓间充质干细胞(bmMSCs)是最早发现并经过充分研究的MSCs。追溯T2DM第一个临床研究,是将胰内bmMSCs输注与高压氧治疗(HOT)进行联合,该试验在1年的随访中发现T2DM患者的代谢参数逐渐改善,而且胰岛素需求量明显降低。随后的多项临床试验和基础研究也证实了 MSCs在T2DM中发挥了降糖、改善胰岛功能和肝脏糖脂代谢等治疗效果。但是关于MSCs是通过何种途径发挥治疗作用的研究相对不足。外泌体(exosome)直径约100 nm、是由脂质双分子层包裹的囊泡,它的来源广泛,可以在体内(主要从体液,例如血浆/血清,尿液,脑脊液,唾液等)和体外(从细胞条件培养基中)进行分离提取。Exosome通过传递囊泡内包含的RNA(mRNA,miRNA和其他RNA)、蛋白质和脂质等物质进行细胞间通讯,影响包括细胞因子的产生、细胞增殖、凋亡和新陈代谢等多种生命活动。既往研究认为MSCs输注后可到达受损胰腺组织,进行胰岛β细胞的原位修复及促进再生。越来越多的证据表明,MSCs对T2DM治疗效果不是由于直接分化为功能性β细胞,而是由旁分泌尤其是exosome介导的。Exosome携带的RNA中主要为miRNA,已证实miRNA在调节胰岛β细胞功能方面起着至关重要的作用。基于以上研究成果,我们作出以下假设:1、MSCs来源的exosome可通过改善肝糖代谢、胰岛功能发挥治疗T2DM的作用;2、exosome主要通过携带的miRNA作用于下游信号通路进而影响胰岛β细胞去分化。第一部分间充质干细胞来源外泌体对2型糖尿病肝糖代谢及胰岛功能的影响目的探究骨髓间充质干细胞(bmMSCs)及其来源的外泌体(bmMDEs)对T2DM胰岛功能及肝糖代谢的影响。方法1.bmMSCs及bmMDEs提取及鉴定后,用Cy7和PKH67标记bmMDEs分别进行体内外exosome摄取情况验证。2.通过高脂饮食+小剂量STZ诱导建立T2DM大鼠模型。T2DM组大鼠随机分为3组,尾静脉分别输注PBS、bmMSCs及bmMDEs,每周检测大鼠体重和血糖。3.bmMSCs和bmMDEs干预结束后行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)和腹腔胰岛素耐量实验(IPITT),并检测血清胰岛素水平和α/β细胞免疫荧光。4.Western blotting检测bmMDEs干预对SD大鼠糖酵解相关酶(GCK、PFK和PK)、糖原合成相关酶(p-GSK3β/GSK3β)和肝糖异生相关酶(PEPCK和G-6-P)表达的影响。PAS染色检测糖原累积情况。结果1.培养的bmMSCs光镜下观察呈长梭形、旋涡状。定向诱导分化结果显示bmMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞,流式细胞仪检测bmMSCs高表达干细胞标记物CD90、低表达造血标记物CD45和CD34。分离的bmMDEs直径约100 nm,呈“杯状”或“盘状”,Western blot结果显示外泌体标志物CD9和TSG101高表达、细胞标志物Calnexin低表达。Cy7标记bmMDEs的体内示踪结果显示各器官(心脏、肺、肝脏、胰腺、脾脏、肾脏和小肠)均有很强的荧光信号,提示尾静脉bmMDEs输注后可成功到达受损胰腺组织。PKH67标记bmMDEs的体外示踪结果证明bmMDEs与INS-1细胞共培养24小时后,在细胞内检测到大量绿色点状荧光。2.高脂饮食与STZ注射建模后,检测模型组SD大鼠空腹血糖均>16.7mmol/L。与T2DM组相比,bmMSCs干预后大鼠空腹血糖显著降低、体重相对升高。bmMDEs也显示出了类似的治疗效果。3.IPGTT和IPITT实验提示bmMSCs和bmMDEs治疗后的T2DM大鼠葡萄糖耐量异常和胰岛素敏感性下降得到显着改善。与T2DM组相比,bmMDEs治疗后血清胰岛素水平明显升高,大鼠胰岛体积增加,Insulin 阳性细胞比例回升,Glucagon 阳性细胞比例有所下降。4.BmMDEs干预的T2DM大鼠糖酵解相关酶(GCK、PFK和PK)和p-GSK3β/GSK3β上调,而肝糖异生相关酶(PEPCK和G-6-P)与T2DM组相比有所降低。BmMDEs还增加了 T2DM大鼠肝组织PAS 阳性染色。结论1.bmMSCs可显著降低T2DM大鼠血糖、改善胰岛素抵抗。2.bmMDEs除降低T2DM大鼠血糖、改善胰岛素抵抗之外,还可以升高血清胰岛素水平、逆转胰岛α/β细胞比率。3.bmMDEs可改善肝脏糖代谢,主要表现为促进糖酵解和糖原合成,同时抑制糖异生。第二部分间充质干细胞来源外泌体对2型糖尿病胰岛β细胞去分化的作用及机制研究目的探究bmMDEs对T2DM胰岛β细胞去分化的作用及机制。方法1.免疫荧光染色检测各组胰岛β细胞去分化情况,qRT-PCR检测各组分离的原代胰岛中去分化相关指标。2.提取的原代离体胰岛、INS-1细胞分别用33.3 mmol/L葡萄糖刺激72小时,GSIS实验检测各组糖负荷后的胰岛素分泌水平,免疫荧光和qRT-PCR检测β细胞去分化情况。3.分别用bmMDEs和exosome对照(INS-1细胞来源外泌体,IDEs)干预高糖诱导的原代胰岛和INS-1细胞,检测干预前后的胰岛素分泌水平和β细胞去分化的变化。4.对INS-1细胞来源的外泌体(IDEs)、HG处理的INS-1细胞来源的外泌体(HG-treated INS-1 cell-derived exosomes,HIDEs)及 bmMDEs 进行 miRNA 高通量测序。GSIS功能实验初步筛选目的miRNA。5.结合miRNA mimics和inhibitor,分别用GSIS实验和qRT-PCR检测目的miRNA对高糖诱导β细胞去分化的影响。6.目的miRNA下游靶基因预测及功能验证。7.慢病毒转染建立目的miRNA敲除的稳转MSCs,提取外泌体后静脉输注T2DM大鼠,观察bmMDEs抑制目的miRNA后的治疗效果。结果1.免疫荧光染色显示,相较于对照组,T2DM组胰岛β细胞标志物(PDX1、FOXO1)表达下降、胰岛祖细胞标志物(NGN3、OCT4)表达显著上升;bmMDEs干预后PDX1、FOXO1表达上调、NGN3、OCT4表达下调。各组来源的原代胰岛去分化PCR检测显示出于免疫荧光类似的结果。2.高糖诱导INS-1细胞和原代胰岛72小时后,GSIS实验显示诱导组高糖负荷后的胰岛素分泌能力下降,免疫荧光和PCR结果表明高糖诱导的胰岛发生了去分化,bmMDEs干预后去分化水平降低。INS-1细胞在高糖干预后Pdx1和Foxo1表达减少、bmMDEs干预后表达上调,Ngn3和Oct4表达与正常对照组无明显差异。3.根据miRNA高通量测序结果做出热图,对差异前10位的miRNAs进行qRT-PCR验证。GSIS实验显示用前10位mi miRNA mimics预处理INS-1,然后加入高糖培养基继续培养72小时,miR-146a-5p(R-146a)mimics较其他miRNAs明显增加了糖负荷后的胰岛素分泌,且在胰岛中得到进一步证实。所以我们初步选定miR-146a进行下一步研究。4.qRT-PCR结果显示,在原代培养胰岛中,miR-146a mimics干预后Pdx1和Foxo1 mRNA 表达水平升高、Ngn3 mRNA 水平降低。miR-146a inhibitor 减弱了bmMDEs抑制β细胞去分化的作用。5.通过TargetScan靶基因预测数据库和荧光素酶报告基因检测,我们发现NUMB是miR-146a的直接下游靶基因,且在T2DM大鼠及高糖诱导的原代胰岛和INS-1细胞中表达增高。体外质粒转染NUMB过表达后,Pdx1和Foxo1的表达水平明显降低、Ngn3和Oct4的表达水平则明显升高,siRNA转染抑制NUMB后β细胞标志基因表达升高、祖细胞标志基因表达降低。随后我们进一步证明了 β-catenin作为NUMB的下游信号分子,也参与了对β细胞去分化的调控。6.慢病毒转染敲低了 bmMSCs中miR-146a的表达,提取外泌体(bmMDEsmiR-146a KD)后尾静脉输注T2DM大鼠。发现miR-146a抑制后,bmMDEs的降低血糖、改善胰岛功能及验证胰岛β细胞去分化的作用显著减弱。结论1.bmMDEs可抑制T2DM胰岛β细胞去分化。2.bmMDEs可通过携带的miR-146a发挥降低T2DM大鼠血糖、改善胰岛功能、抑制β细胞去分化的作用。3.bmMDEs携带的miR-146a通过作用于NUMB/β-catenin信号通路,进而达到改善胰岛素分泌、抑制β细胞去分化的作用。