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碱性磷酸酶,谷氨酸氧化酶和乙醇氧化酶在食品或医学检测等领域具有重要的应用价值。本工作以提高重组蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中的表达量为目的。首先以碱性磷酸酶(Apase)和谷氨酸氧化酶(GOX)为目标蛋白,通过选择合适的策略来提高它们在大肠杆菌中的可溶表达量；接着以乙醇氧化酶(AOX)为目标蛋白,通过培养条件与诱导条件优化来提高其在毕赤酵母中的产量,特别是提高其蛋白的分泌表达。探究它们的功能特性,为开发简便、高效的检测方法提供必要的功能蛋白。首先分析了不同大肠杆菌表达宿主BL21(DE3), Rosetta(DE3), C41(DE3)和C43(DE3)对碱性磷酸酶可溶表达的影响,结果表明APase在Rosetta(DE3)中的表可溶表达量最高。该重组APase对表面活性剂和蛋白酶有一定的耐受性,另外,金属离子Ca2+与Mg2+对该酶的活性有促进作用。对于谷氨酸氧化酶,本文将构建好的重组质粒pET28a-GOX转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达,蛋白可溶表达量可以达到234mg/L,重组谷氨酸氧化酶的总活力为6660U/L。在谷氨酸氧化酶蛋白酶酶切筛选过程中,成功选择到可以把重组GOX前体酶切成成熟GOX的碱性蛋白酶和蛋白酶K。研究表明,成熟的GOX在催化活性与热稳定性上较其前体有了非常大的提高。通过进一步研究表明,GOX前体和成熟的GOX的分子量分别为150kDa与142kDa。另外,本文成功实现来源于毕赤酵母的乙醇氧化酶的重组表达,并通过对重组工程菌的培养条件与诱导条件的优化来提高重组AOX的产量,使AOX的总产量达到1862U/L,其中分泌AOX占总目标蛋白30%左右。利用亲和纯化系统对重组AOX进行纯化,使蛋白纯度达到93.2%,其回收率为68.9%。对AOX的性质研究表明,重组AOX的热稳定性较野生毕赤酵母来源的AOX,有相当大的提高；有机试剂对酶的稳定性影响不大；H202对酶的底物抑制属于竞争性抑制,其Ki值为1.28mM。以上各项研究均为这些检测用酶的工业及商业化应用提供有利的参考。