论文部分内容阅读
目的探讨间充质干细胞(MSCs)对血管内皮祖细胞(EPCs)向内皮细胞(ECs)分化的影响及其机制。方法1.分离、培养及扩增小鼠骨髓MSCs和EPCs;2.MSCs与EPCs在Transwell小室内共培养;3.倒置光学显微镜下观察EPCs单独培养组、MSCs与EPCs共培养组及血管内皮生长因子组(VEGF组)细胞形态学发生的变化;4.免疫荧光、RT-PCR和Western-blot检测各组内皮细胞特异性表面标志CD31及血管性血友病因子(v WF)的表达;5.ELISA检测EPCs单独培养组、MSCs与EPCs共培养组及VEGF组细胞上清液中VEGF的表达;6.ELISA检测间充质干细胞条件培养基(MSCCM)中VEGF的含量;7.MSCCM诱导EPCs,同时用VEGF抗体(Anti-VEGF)中和MSCCM,免疫荧光、RT-PCR和Western-blot检测LG-DMEM组、MSCCM组、MSCCM+Ig G组、MSCCM+VEGF抗体组CD31和v WF的表达情况。结果1.在MSCs与EPCs共培养实验中,我们把实验分成了三组:EPCs单独培养组、MSCs与EPCs共培养组、VEGF组,在细胞培养48 h后首先在倒置光学显微镜下观察了各组细胞形态学发生的变化,结果显示MSCs与EPCs共培养组、VEGF组细胞呈鹅卵石样生长,而EPCs单独培养组细胞呈细胞点状、不规则样生长。2.免疫荧光显示MSCs与EPCs共培养组、VEGF组高表达CD31及v WF,EPCs单独培养组低表达CD31及v WF;RT-PCR检测了各组细胞CD31及v WF m RNA的表达情况,结果共培养组CD31、v WF表达(5.45±1.45,7.50±1.11),较EPCs单独培养组表达(1.20±0.10,1.15±0.08)显著升高(**P<0.01),差异具有统计学意义;VEGF组CD31、v WF表达(4.29±1.15,3.32±0.66),较EPCs单独培养组表达(1.20±0.10,1.15±0.08)显著升高(*P<0.05),差异具有统计学意义。Western-blot检测了各组细胞CD31及v WF蛋白表达情况,结果共培养组CD31、v WF表达(1378.23±67.81,141.70±8.50),较EPCs单独培养组表达(519.87±72.83,28.20±3.40)显著升高(**P<0.01),差异具有统计学意义;VEGF组CD31、v WF表达(917.33±19.92,69.36±5.45),较EPCs单独培养组表达(519.87±72.83,28.20±3.40)显著升高(**P<0.01),差异具有统计学意义。共培养组CD31、v WF表达较VEGF组明显升高(**P<0.01),差异具有统计学意义。3.ELISA检测了三组细胞上清液中VEGF的含量,结果对照组VEGF的含量为(85.47±8.80)pg/ml,共培养组VEGF的含量为(340.94±14.17)pg/ml,较对照组显著升高(**P<0.01)。VEGF组VEGF的含量为(360.67±13.47)pg/ml,较对照组明显升高(**P<0.01)。4.MSCs分泌VEGF,MSCCM中VEGF的含量为(166.03±11.09)pg/ml,较LG-DMEM中VEGF的含量(11.77±3.04)pg/ml显著升高(**P<0.01)。5.免疫荧光显示MSCCM组、MSCCM+Ig G组高表达CD31及v WF,LG-DMEM组低表达CD31及v WF,MSCCM+VEGF抗体组CD31及v WF的表达较MSCCM组减弱。6.RT-PCR检测了四组细胞CD31及v WF m RNA的表达情况,结果MSCCM组CD31、v WF表达(2.85±0.55,3.78±0.95),较LG-DMEM组表达(1.05±0.05,1.06±0.07)显著升高(**P<0.01),差异具有统计学意义,MSCCM组CD31、v WF表达(2.85±0.55,3.78±0.95),较MSCCM+VEGF抗体组表达(1.88±0.16,2.30±0.39)显著升高(*P<0.05),差异具有统计学意义。7.Western-blot检测了四组细胞CD31及v WF蛋白表达情况,结果MSCCM组CD31、v WF表达(278.06±7.52,87.13±7.60),较LG-DMEM组表达(93.80±7.75,29.40±4.32)显著升高(**P<0.01),差异具有统计学意义;MSCCM组CD31、v WF表达(278.06±7.52,87.13±7.60),较MSCCM+VEGF抗体组表达(176.10±15.41,51.76±4.01)显著升高(**P<0.01),差异具有统计学意义。结论1.体外MSCs与EPCs与共培养能促进其向ECs分化;2.MSCs促进EPCs向ECs分化,其机制或许是通过旁分泌VEGF完成的。