研究背景组蛋白共价修饰是一种重要的表观遗传模式,包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化以及泛素化等,其中乙酰化与甲基化是目前研究比较多的组蛋白修饰方式。2004年Shi等人的研究组发现赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(Lysine specific demethylase 1, LSD1),打破了以往认为组蛋白甲基化不可逆的观点。在LSD1催化去甲基化反应的过程中,不同的分子伴侣可以介导LSD1作用于不同的底物,从而产生不同的生物学效应。LSD1通过阻遏元素沉默转录因子辅阻遏物(Co-repressor of the repressor element silencing transcription factor, CoREST)复合体与靶基因结合时,可以使组蛋白H3上第4位赖氨酸(Lysine, K) H3K4去甲基化,该过程与染色质浓缩及转录抑制有关,此时LSD1作为转录抑制因子抑制基因的表达。LSD1与雄激素受体(Androgen Receptor, AR)或者雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)结合后,可以特异性的催化组蛋白H3上第位赖氨酸(H3K9)的去甲基化。H3K9的去甲基化与染色质的开放构象和基因表达相关,此时AR/ER依赖的基因表达上调,LSD1促进转录激活。近年来多项功能研究发现LSD1通过调节靶基因的表达,在肿瘤的发生、胚胎分化、异染色质的形成、细胞内DNA甲基化状态的合理维持以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS cell)形成等多方面起到重要作用。前期相关研究发现在前列腺癌、乳腺癌以及血液系统肿瘤等方面,普遍发现LSD1的高表达,通过敲除LSD1或抑制LSD1作用后,可以明显抑制肿瘤细胞的增殖。另外,目前已经有多种组蛋白修饰酶抑制剂用于肿瘤的治疗,如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Inhibitors of histone deacetylases, HDACi),而LSD1抑制剂也有望成为抗肿瘤药物开发的新靶点。深刻认识并揭示LSD1的作用机制和组蛋白甲基化与去甲基化动态平衡机制,对于肿瘤防治药物的开发具有重要意义。食管癌是世界第八大肿瘤,其发生具有明显的地域性,亚洲地区是食管癌高发区之一。早期食管癌患者手术治疗后5年生存率高,随着食管癌的进展,中晚期食管癌患者预后不良,尤其是伴有转移的患者。同时由于食管癌的早期检出率偏低,严重影响了该病的治疗效果。前期研究发现,如同其他大部分恶性肿瘤一样,食管癌的发生和发展经历了遗传物质及表观遗传修饰的双重突变,而表观遗传修饰的可逆性也昭示着食管癌预防和有效治疗的可能性。LSD1在食管癌中的表达和作用机制目前仍不明确,本研究试阐明LSD1在食管癌的发生和发展中可能起到的作用,为食管癌发生发展机制的深入探讨以及临床诊断和治疗奠定初步基础。研究目的本研究通过对食管癌组织及其组织芯片,食管癌癌前病变以及正常食管黏膜中LSD1表达情况的研究,揭示LSD1表达量与食管癌恶性程度、浸润深度、转移等生物学性质的关系,推测LSD1的表达与食管癌患者预后的可能关联。同时通过检测及干预食管癌细胞株内LSD1的表达和作用,观察细胞的增殖、凋亡、浸润以及转移能力变化,进一步探讨LSD1在食管癌发生和发展中起到的可能作用,从而为食管癌的预防和治疗提供新的方案。研究方法一、组织标本实验：探讨LSD1在不同临床组织标本中的表达及意义实验分组：正常食管黏膜组织、食管癌癌前病变组织(上皮内瘤变及不典型增生等)及其人食管鳞癌组织三组。实验步骤：制作组织蜡块及组织芯片,HE染色明确临床诊断。免疫组化染色,检测上述组织中LSD1和肿瘤增殖抗原Ki67的表达情况,TUNEL检测食管癌组织芯片中细胞凋亡情况,由两位病理医师根据免疫反应积分打分法(Immnohistochemical semi-quantitative Remmele scoring system, IRS)对染色结果分别进行评分,即：免疫组化染色的评分同时考虑免疫反应染色强度(staining intensity, SI)和阳性细胞百分比(positive percent, PP)。SI分值：0分为未见阳性细胞,1分为细胞阳性染色最强处呈现弱阳性,2分为阳性,3分为可见强阳性染色的细胞；PP分为5级：0分为无染色阳性区域,1分为阳性染色区域≤10%,2分为阳性区域介于11%～50%,3分51%～80%,当阳性染色区域>80%时为4分。IHC得分=SI×PP。最后按得分将结果区分为阴性表达、高表达与低表达三组：阴性即最终积分为0,低表达即0<积分≤4分,评分>4分为高表达。经过对食管鳞癌患者术后的随访,获取患者基本资料、相关临床治疗方案及预后信息。分析LSD1表达量与食管癌患者病例资料及预后信息的关系,探讨LSD1表达与细胞增殖及凋亡的关系。二、细胞实验：探讨LSD1表达对食管癌细胞株部分生物学行为的影响实验分组：根据食管癌细胞株的不同,分为KYSE150、KYSE450以及EC109三组。实验步骤：使用Western Blot及RT-PCR检测LSD1在不同食管癌细胞株内的蛋白和RNA表达水平。Transwell及划痕实验检测食管癌细胞株在不同LSD1表达水平时的侵袭及运动能力。三、干扰实验：敲除LSD1的表达或抑制LSD1的作用,观察食管癌细胞株生物学行为的改变1.慢病毒稳定敲除食管癌细胞株KYSE450中LSD1的表达,根据敲除程度的不同分为两组,同时转染无敲除能力的慢病毒作为对照组。以绿色荧光蛋白(GFP)的稳定表达作为慢病毒转染成功的标志。实验分组：慢病毒敲除组1(KD1),慢病毒敲除组2(KD2)以及空载慢病毒转染的对照组(Negative Control)。实验步骤：构建慢病毒敲除食管癌细胞株内LSD1的表达并用Western Blot及RT-PCR的方法进行验证。检测食管癌细胞株经LSD1敲除后,侵袭及运动能力的改变。分析细胞生物学行为的改变与LSD1表达的关系。2.LSD1抑制剂tranylcypromine以不同浓度作用于食管癌细胞株KYSE450,抑制LSD1的去甲基化作用,检测细胞株内蛋白表达并观察细胞株生物行为的改变。实验分组：根据LSD1抑制剂浓度的不同进行分组,最终作用浓度：0uM(对照),50uM以及250uM。实验步骤：以tranylcypromine不同浓度作用于KYSE450细胞株,培养24h后提取细胞株蛋白。以WB的方法检测细胞内LSD1、H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1以及K3K9me2的表达,确定LSD1在食管癌细胞株KYSE450内可能的作用位点。同时,采用划痕实验、Transwell实验等检测抑制剂不同作用浓度时,细胞侵袭和运动能力的变化。研究结果1.获取正常食管组织29例,食管癌癌前病变组织23例及食管癌组织134例。免疫组化检测LSD1情况,发现LSD1在51.7%的正常上皮组织基底部有少量表达；在癌前病变组织内表达阳性率为73.9%,也均为低表达；肿瘤组织中表达阳性率为75.4%,其中43.7%的组织内LSD1表达为强阳性。肿瘤组织中LSD1表达明显强于正常组织(p<0.01)及处于癌前病变期的食管黏膜组织(p<0.01)。2.LSD1表达与患者的性别、年龄等基本临床资料无相关性,与肿瘤的生长类型、分化程度以及浸润深度等病理资料也无明显相关。但LSD1表达高低与食管癌的淋巴结转移有关(p<0.05),且明显影响患者的生存期,LSD1高表达的患者预后明显差于LSD1低表达组(p<0.01)。3.LSD1表达与Ki67均表达在增殖能力比较强的正常食管上皮基底部,且在食管癌组织中LSD1的表达与Ki67具有显著相关性(p<0.01),LSD1高表达时Ki67的表达也明显增多。LSD1表达与食管癌肿瘤细胞凋亡无显著相关性,在食管癌组织切片中凋亡细胞很少,无论LSD1表达高或者低。4.食管癌细胞株KYSE450, KYSE150及EC109内,LSD1表达量不同,其中KYSE450及KYSE150细胞株内LSD1表达水平明显高于EC109细胞(p<0.01)。5.划痕实验及Transwell实验证实KYSE450及KYSE150细胞的运动能力和侵袭能力均较EC109细胞强(p<0.01)。6.慢病毒转染敲除KSE450细胞内LSD1的表达后,得到两株敲除水平不同的KYSE450细胞,与对照细胞比,敲除LSD1的KYSE450细胞运动和侵袭能力明显降低,且与LSD1表达水平有关。7.LSD1抑制剂tranylcypromine作用于KYSE450细胞后,细胞内H3K4me1表达量随作用浓度增高而降低,H3K4me2随作用浓度增高而增高,H3K9甲基化水平未出现明显变化。8. Tranylcypromine可以明显抑制KYSE450细胞的运动和侵袭能力,且抑制强度随药物作用浓度的升高而增加。研究结论1.LSD1在食管癌中表达明显高于正常食管组织及食管癌癌前病变组织,且LSD1的表达增多与食管癌患者的淋巴结转移相关,并能影响患者预后。LSD1表达增多与Ki67表达增多正相关,可能与食管癌的增殖能力有关,但与食管癌细胞凋亡无关。2.不同食管癌细胞株表达LSD1的水平不同,其中侵袭和运动能力较强的KYSE450和KYS150细胞株中LSD1表达较高。3.慢病毒敲除KYSE450中LSD1的表达后,细胞运动和侵袭能力明显下降。LSDl抑制剂Tranylcypromine处理KYSE450细胞,可以明显抑制细胞的侵袭和转移,同时发现H3K4的甲基化状态发生变化,因此推测LSD1是在食管癌内是通过对H3K4的去甲基化发挥作用。