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第一部分小鼠Betatrophin基因表达载体构建及鉴定目的:构建小鼠Betatrophin基因重组质粒(p IRES2-EGFP-Betatrophin),并用于C57 BL/6J小鼠的原代肝细胞转染。方法:提取小鼠肝脏组织Total RNA,经逆转录(RT-PCR)获得c DNA。后续PCR扩增得到Betatrophin CDS序列全长。经双酶切,连接到真核表达载体p IRES2-EGFP上,构建成p IRES2-EGFP-Betatrophin,后续通过双酶切+凝胶电泳、DNA测序、Blast对重组质粒进行鉴定。结果:将重组质粒(p IRES2-EGFP-Betatrophin)和经过双酶切的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像后前者(p IRES2-EGFP-Betatrophin重组质粒)出现在对应Marker 5897bp的位置;后者出现两条线性化条带,分别在对应Marker 597bp(Betatrophin CDS全长序列)位置和5.3kb(p IRES2-EGFP线性条带)位置,初步确定重组质粒构建成功。测序结果同Genbank中Betatrophin m RNA所编码的CDS序列全长在NCBI中进行DNA序列比对,比对结果完全一致,证明所克隆的基因就是小鼠Betatrophin c DNA。结论:成功构建真核表达载体p IRES2-EGFP-Betatrophin。第二部分Betatrophin在小鼠组织中的表达目的:探索普食、高脂喂养的C57BL/6J小鼠组织中,Betatrophin m RNA和蛋白表达差异。方法:取高脂饲料喂养(HFD)28周的C57BL/6J小鼠(5只)、普食喂养(SD)的同龄C57BL/6J小鼠(5只)处死取肝脏、脂肪组织于液氮中保存,后续提取各对应组织RNA并逆转录为c DNA,再通过实时定量荧光PCR测定Betatrophin的m RNA表达差异;提取各对应组织总蛋白,通过Western blot方法测定Betatrophin的蛋白表达差异。结果:Betatrophin mRNA和蛋白表达量在HFD小鼠的肝脏和脂肪组织中明显高于(p<0.05或p<0.01)SD小鼠对应组织;结论:提示,Betatrophin的表达可能与小鼠机体的胰岛素抵抗相关。第三部分Betatrophin在肝细胞中的表达及其对胰岛素信号通路的影响目的:探索胰岛素抵抗状态的小鼠肝原代细胞Betatrophin基因表达情况,以及Betatrophin过表达对增加小鼠肝细胞胰岛素抵抗的机制。方法:分离C57BL/6J小鼠原代肝细胞,分组培养。使用浓度递增的胰岛素处理;经一定浓度胰岛素处理24h的原代肝细胞再通过罗格列酮或者二甲双胍作用,通过定量PCR及Western blot检测Betatrophin表达。原代肝细胞和巨噬细胞RAW264.7共培养;另外组使用罗格列酮或者二甲双胍处理共培养体系细胞,通过定量PCR及Western blot检测Betatrophin表达情况;另外各组原代肝细胞分别加2%(在培养基中所占体积比)的PBS(空白对照)、正常人血清(normal)、PCOS患者未治疗者血清(Before metformin)、PCOS患者二甲双胍治疗3个月血清(3months after metformin)、PCOS患者二甲双胍治疗6个月的血清(6months after metformin)培养24小时,再通过定量PCR及Western blot检测Betatrophin、P-Ins R以及P-AKT表达;最后用过表达质粒以及干扰RNA转染小鼠肝原代细胞48h,定量PCR以及Western blot检测Betatrophin、P-Ins R以及P-AKT表达情况。结果:随着insulin浓度梯度的增加,insulin处理的肝原代Betatrophin表达逐渐增高(p<0.05或p<0.01),同时经一定浓度insulin作用24h的肝原代细胞再用不同浓度罗格列酮或者二甲双胍处理后Betatrophin表达显著下降(p<0.05或p<0.01);肝原代细胞、巨噬细胞264.7共培养体系在经罗格列酮或者二甲双胍作用后Betatrophin表达显著降低(p<0.05或p<0.01);Betatrophin过表达组的P-Ins R、P-AKT表达同对照组比明显降低(p<0.01),Betatrophin干扰组的P-Ins R、P-AKT表达相对于对照组显著升高(p<0.01)。结论:Betatrophin表达与胰岛素抵抗相关,Betatrophin基因过表达可能抑制了PI3K/Akt信号通路,降低胰岛素敏感性,从而增强肝细胞胰岛素抵抗。