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背景和目的:肺癌是全世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌分非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC);其中NSCLC在所有肺癌中约占85%。由于在实体瘤患者中,90%的癌症死于转移,因此阐明潜在的肺癌转移机制显得尤为重要。转化生长因子β(TGF-β)是细胞生理过程中普遍存在的、重要的调节因子,如调节细胞的增殖,迁移,侵袭和免疫监视。核心蛋白聚糖(DCN)是存在于细胞外基质的、富含亮氨酸的、小分子蛋白聚糖家族的成员。它可以特异地结合TGF-β并部分阻断TGF-β的信号传导途径,从而抑制远端肿瘤,包括肺癌在内的细胞生长。然而,对于何种机制导致DCN的低表达并促进肺癌的转移尚不清楚。在我们的研究中,我们探讨了在转移的NSCLC细胞中,DNA甲基化这一表观遗传学因素是否能够导致DCN失活并影响TGF-β/Smad信号通路。方法:(1)、检测低转移的95C和高转移的95D非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力。(2)、以β-actin为内参,用q-PCR检测DCN的表达,验证DCN的表达是否会随着细胞转移能力的增强而降低。(3)、用浓度为10um的5-Aza去甲基化药物处理95C和95D细胞。5天后提取细胞DNA和RNA检测DNA甲基化和DNC基因表达的关系(。4)、选取DCN基因近端启动子(-200~+1)和5’-UTR (+1~+1,030)共1231bp片段,并用Methyl Primer Express Software v1.0和TFSEARCH软件预测含有转录因子结合的CpG位点。(5)、用95C、95D细胞和III和IV的非小细胞肺癌病人组织验证预测的功能性+58CpG位点甲基化与DCN表达之间的关系(。6)、用Western Blot检测转录因子AHR在95C和95D细胞中是否表达。(7)、在95C和95D细胞中,用ChIP方法分析AHR能否与+58CpG位点结合。(8)、用EMSA以及构建荧光素酶报告基因来验证+58CpG位点甲基化能够降低AHR的结合能力。(9)、ELISA实验检测DCN蛋白的表达水平。(10)、用磷酸化的SMAD3与SMAD3之间的比值以及EMT标记分子E-cadherin来衡量TGF-β通路的活性水平。结果:(1)DNA甲基化参与了DCN mRNA的表达。(2)经软件预测,+58CpG位点是一个潜在的功能性CpG位点。(3)在转移的NSCLC细胞中,95D细胞的+58CpG位点甲基化频率明显高于95C细胞,而且与DCN的表达具有相关性。(4)AHR能够与DCN基因5′-UTR区的+58CpG位点结合。(5)+58CpG位点的甲基化能够影响转录因子与DCN基因5′-UTR区的结合能力。(6)+58CpG位点的甲基化能够抑制荧光素酶报告基因的活性。(7)在转移的NSCLC细胞中,DCN抑制了磷酸化的SMAD3并增强了E-cadherin的表达。结论:在这项研究中,我们发现了在高转移性非小细胞肺癌细胞中,DCN基因5’-UTR区甲基化的+58CpG与DCN mRNA表达降低有关。我们的研究结果显示,+58CpG甲基化可能是导致AHR低招募到DCN5’-UTR区的机制之一,从而促进TGF-β/Smad信号增强磷酸化Smad3蛋白表达,最终下调E-cadherin的表达。