【背景】肾脏纤维化是各种慢性肾脏病发展为终末期肾病的最终共同途径,一般需要肾脏替代治疗,如得不到及时处理,甚至导致死亡。肾纤维化是炎症损伤修复的反应各种肾脏损伤都能引起小管上皮细胞的变性坏死,同时伴随着各种炎症细胞浸润和炎性因子释放,导致成纤维细胞的激活和增生,最终造成促纤维化物质的形成和ECM的大量堆积。前人对肾纤维化的病理生理机制进行了大量的探索性研究,尽管取得了一系列阶段性的成果,但对其发病机制仍不甚明了。从细胞层面讲,肾脏自身细胞和骨髓来源的细胞共同参与肾损伤的进展。肾脏损伤后炎症介质诱导骨髓细胞浸润到肾间质,尤其是单核巨噬细胞介导的先天免疫反应尤为突出。以往研究发现巨噬细胞具有促纤维化作用,而近几年研究发现巨噬细胞不仅发挥促纤维化角色,甚至还能改善肾纤维化。主要原因与巨噬细胞的异质性有关。但关于巨噬细胞异质性在肾纤维化中的作用和机制目前尚不清楚。大量的研究显示多种信号通路参与调控巨噬细胞的活化,其中Notch信号是调控巨噬细胞活化的重要信号通路之一,提示:Notch信号可能通过调控巨噬细胞的活化参与肾纤维化进程。Notch信号是进化上高度保守的单次跨膜受体蛋白,当机体受到外界刺激时,Notch信号介导细胞间的信息传递,参与调控细胞发育的一系列生物学行为。大量研究显示Notch信号不仅参与肾小管、集合管发育,而且与肾纤维化的形成密切相关。最近研究显示在小管上皮细胞特异性敲除Notch后纤维化程度减轻,提示:Notch信号可以促进肾纤维化的进展。已知肾纤维化是个慢性炎症损伤修复的过程,作为炎症的起始应答细胞的巨噬细胞在肾纤维化的发生发展中发挥重要作用。那么在巨噬细胞中特异性敲除或激活Notch信号通路是否影响纤维化的进程是个令人感兴趣的问题。【目的】为了更全面的阐明Notch信号调控巨噬细胞参与肾纤维化的作用和机制,我们利用巨噬细胞特异性Notch信号敲除或激活的小鼠模型,在UUO诱导的肾纤维化模型中,利用分子生物学和免疫学方法,从分子、细胞和动物水平分析Notch信号调控巨噬细胞参与肾纤维化的作用和机制,以期为将来靶向巨噬细胞干预Notch信号进行肾纤维化治疗提供新靶点和新策略。【方法】1.将对照小鼠(lyz2-cre/RBP-J+/flox)、巨噬细胞特异性RBP-J剔除小鼠(lyz2-cre/RBP-Jflox/flox)、巨噬细胞特异性激活Notch小鼠(lyz2-cre/STOPflox-NICD)的左侧输尿管结扎,建立UUO模型。2.Masson、免疫荧光染色、q RT-PCR检测小鼠UUO模型中纤维化水平的变化。3.H&E,q RT-PCR、ELISA检测小鼠UUO模型中炎性细胞浸润以及促炎促纤维化因子的变化。4.免疫荧光染色、流式细胞术、q RT-PCR检测巨噬细胞的浸润及极化;q RT-PCR、免疫荧光染色检测肾纤维化中巨噬细胞Notch信号的活化。5.Western blot、q RT-PCR、体外共培养实验检测在巨噬细胞特异性阻断RBP-J后肾小管上皮细胞EMT的改变。6.利用脂质体包裹的氯磷酸盐清除肾脏组织定居型巨噬细胞实验,通过FACS、组织学染色检测组织定居巨噬细胞对肾脏纤维化贡献。7.利用Brdu体内参入实验,通过FACS检测巨噬细胞增殖对肾纤维化的贡献。【结果】1.成功建立UUO诱导的纤维化模型。2.UUO第14天时纤维化程度和间质炎症细胞浸润都高于第7天;UUO后巨噬细胞浸润明显增多,且第7天和14天以M2型巨噬细胞浸润为主,然而UUO第7天和14天时M1型巨噬细胞的数量没有显著不同。3.纤维化过程中巨噬细胞的Notch信号通路被激活。4.巨噬细胞特异性敲除Notch信号后,肾脏纤维化程度减轻。表现在:Notch信号剔除后抑制了EMT发生和促纤维化因子释放;减少了炎症细胞浸润和炎症因子的释放。5.氯磷酸盐清除肾脏原位巨噬细胞结果显示:Notch主要通过影响骨髓来源的巨噬细胞参与肾纤维化;另外阻断Notch信号并不影响炎性巨噬细胞的增殖。6.巨噬细胞特异性敲除Notch信号后,肾脏中巨噬细胞的浸润减少,其中巨噬细胞中CCR2表达显著减少;FACS结果显示大量的CCR2+的单核-巨噬细胞被滞留在骨髓。7.利用巨噬细胞特异性激活Notch的小鼠建立小鼠纤维化模型后,FACS、组织学染色结果显示:肾脏中CCR2+炎症巨噬细胞的募集增多,肾脏纤维化水平加重。【结论】1.UUO诱导的肾纤维化后期主要是M2型巨噬细胞参与肾脏纤维化进展。且纤维化肾脏中巨噬细胞的Notch信号通路被激活。2.在UUO诱导的肾纤维化模型中,RBP-J介导的Notch信号的缺失,导致纤维化程度减低。其机制并不是通过影响巨噬细胞增殖和原位巨噬细胞的转化,其主要是通过调控骨髓来源的CCR2+巨噬细胞募集进而参与肾纤维化进展。