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第一部分含人野生型及其致病突变基因A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体的构建目的构建含人野生型及其致病突变基因A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体。方法以RT-PCR方法从人胎脑中克隆野生型SNCA基因;利用单核苷酸差异引物定点诱变法通过PCR构建SNCA基因编码区EcoRⅠ与BamHⅠ位点的同义突变与Ala30Pro(GCA突变为CCA)、Ala53Thr (GCA突变为ACA)致病突变;利用EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切法构建含人野生型及其致病突变基因A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA。结果以重组质粒pEGFP-C3-SNCA为模板,通过PCR可扩增到481bp的目的基因片段;以EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切重组质粒pEGFP-C3-SNCA可得到460bp的目的基因片段;最终以三种重组质粒pEGFP-C3-SNCA的转化菌送基因公司测序证实成功。结论成功构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP -C3-SNCA。第二部分重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA在高分化型PC12细胞中的稳定转染目的以成功构建的SNCA基因WT及A30P与A53T突变型重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,稳定转染高分化型PC12细胞。方法以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418筛选转染的PC12细胞;用有限稀释法进行亚克隆,将单克隆的PC12细胞扩大培养备用;以RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定稳定转染PC12中SNCA基因的表达。结果对于稳定转染目的基因的PC12细胞,RT-PCR方法检测到481bp的目的基因;Western blot可检测到40KDa的GFP-SNCA的目的融合蛋白;荧光显微镜可观察到绿色荧光。结论通过稳定转染,成功获得有同义、A30P与A53T突变SNCA基因稳定表达的单克隆PC12细胞株。第三部分MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞的毒性作用目的研究MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞的毒性作用。方法以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC-PI染色后荧光显微镜检测细胞的凋亡,光镜观察活细胞一般形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构改变,DCF-DA法检测细胞ROS水平,来观察MPP+对细胞的毒性作用。结果(1)MPP+处理后各组细胞活力比较,WT组高于对照组,A30P与A53T组低于对照组;(2) MPP+处理后各组细胞凋亡指数比较,WT组低于对照组,A30P与A53T组高于对照组;(3) MPP+处理后各组细胞光镜形态变化,WT组不显著,A30P与A53T组细胞形态变化明显;(4)各组细胞超微结构,MPP+处理前, A30P、A53T组PC12细胞细胞内溶酶体及自噬体增多; MPP+处理后, A30P、A53T组细胞可见各种凋亡改变,而WT组细胞仅可见自噬和晚期溶酶体,无明显凋亡改变。(5)MPP+处理后WT组细胞ROS水平上升幅度低于对照组细胞,而A30P、A53T组高于对照组细胞,以A53T组细胞更甚。结论过表达人野生型α突触核蛋白保护PC12细胞对MPP+的毒性反应,过表达人A30P与A53T致病突变α突触核蛋白加重PC12细胞对MPP+的毒性反应。第四部分MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞DAT膜表达水平的影响目的研究MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞DAT膜表达水平的影响。方法Western blot检测α突触核蛋白蛋白表达水平;以131I-FP-β-CIT与膜DAT结合的放射活度反映细胞膜DAT水平;生物素化膜蛋白方法检测DAT膜表达;Real time-PCR定量检测DAT和α-Synuclein mRNA的转录水平;激光共聚焦显微镜下观察各组PC12细胞株α突触核蛋白与DAT的共定位。结果(1) Western blot检测示各组细胞MPP+处理后α突触核蛋白的蛋白表达增高。(2)131I-FP-β-CIT的结合实验示MPP+处理后各组细胞株放射性活度降低;相同MPP+处理水平下WT组均低于对照组,A30P组未用MPP+处理时低于对照组,500μM的MPP+处理后与对照组无统计学差异,1000μM的MPP+处理后高于对照组;A53T细胞组在未用MPP+处理时与对照组无统计学差异,经500μM与1000μM MPP+处理后均高于对照组。(3)细胞膜蛋白经生物素化后发现各组细胞MPP+处理后DAT膜表达均呈浓度依赖性下调趋势。相同处理水平下各细胞株与对照组细胞比较,WT组均低于对照组;A30P组在MPP+处理前低于对照组, 1000μM的MPP+处理后高于对照组;A53T组仅在1000μM MPP+处理后高于对照组。(4) Real-time PCR定量检测500μM、1000μM的MPP+处理后各组细胞α突触核蛋白mRNA水平呈浓度依赖性增高,而DAT的mRNA水平无明显统计学差异。(5)激光共聚焦显微镜观察MPP+处理前后α突触核蛋白与DAT的共定位的改善,WT组改善最明显,其次为A30P组与对照组,而A53T组细胞并无改善。结论MPP+处理过程中,人野生型α突触核蛋白促进细胞膜DAT内化,而人A30P与A53T突变α突触核蛋白减缓细胞膜DAT内化。