近年来,随着抗生素在临床上的滥用,耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的临床检出率不断上升。耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌具有高传播率、高致病率、高病死率等特点,并且对绝大部分抗菌药物耐药。因此,寻找具有新型骨架、新型抗菌机理的抗肺炎克雷伯菌先导化合物或药物具有重要意义。本课题前期从蜚蠊肠道分离到一株肠道内生菌WA5-4-31,其发酵液具有较强且稳定的抗肺炎克雷伯菌活性,但其抗菌物质基础不明。本文以菌株WA5-4-31为研究对象,运用形态学、分子生物学和系统发育树等实验方法对菌株WA5-4-31进行初步分类鉴定,并通过牛津杯法初步检测菌株WA5-4-31对不同致病菌的抗菌谱。在此基础上,通过对不同发酵天数、温度、p H值、载液量等因素进行单因素条件优化和中心组合响应面法优化,并根据最佳发酵条件进行大规模发酵,综合运用活性追踪、化学分离、波谱分析等实验方法对菌株WA5-4-31活性次级代谢产物进行初步研究。本论文主要实验结果如下。1.菌株WA5-4-31的分类鉴定:本文利用形态学特征观察、电镜扫描、生物信息学分类等鉴定方法,初步鉴定菌株WA5-4-31为无色杆菌;将扩增的菌株序列信息上传至Gen bank数据库中初步鉴定为无色杆菌,与Achromobacter sp CLC-M28同源性为99%,获得登录号为MN007235。2.无色杆菌WA5-4-31发酵液不同萃取部位抗菌活性及乙酸乙酯萃取物的抗菌谱:无色杆菌WA5-4-31发酵液乙酸乙酯及正丁醇萃取部位进行抗肺炎克雷伯菌活性测定,最终确定菌株发酵液的活性部位为乙酸乙酯部位。牛津杯法测试乙酸乙酯萃取物的抗菌谱（细菌、真菌）,结果显示乙酸乙酯粗提物表现出较广谱抗菌效果。3.无色杆菌WA5-4-31发酵条件优化:基于单因素条件优化和中心组合响应面优化法,以抗肺炎克雷伯菌活性为导向,对无色杆菌WA5-4-31发酵条件进行优化。确定最佳发酵条件为种龄44h、发酵温度为28℃、接种比例为5.0%、p H值为7.0、装液量300mL/500mL、发酵天数9d,在此发酵条件下发酵液提取物抗肺炎克雷伯菌的活性最强,抑菌圈直径达31.13±0.60mm。4.无色杆菌WA5-4-31抗肺炎克雷伯菌活性无色杆菌次级代谢产物的分离鉴定:以最佳发酵条件对无色杆菌WA5-4-31进行大规模发酵,对发酵产物进行浓缩干燥获得粗提物,采用活性追踪结合化学分离技术等手段对发酵液粗提物进行分离纯化,通过核磁共振（NMR）氢谱、碳谱、质谱、以及现代波谱学分析对单体化合物进行解析,最终获得放线菌素D、放线菌素X2、Collismycin A、细胞松弛素E、橘霉素、Neoechinulin A、环-（D-苯丙氨酸-D-脯氨酸）7个化合物,以上单体化合物均在无色杆菌次级代谢产物中首次分离报道。5.单体化合物的生物活性评价:对所获得的7个化合物进行抗菌谱筛查及MIC值测定,结果显示单体化合物放线菌素D、Collismycin A、细胞松弛素E对肺炎克雷伯菌有较好的抑制作用,其MIC值为64μg/mL、16μg/mL、32μg/mL,单体化合物放线菌素D、放线菌素X2、Collismycin A对5种受试菌均表现出较好的抑菌效果。