胰激肽原酶(pancreatic kininogenase)是一种催化大分子前体物释放生物活性肽的酶。胰激肽原酶具有广泛的药用价值,除降血压之外,还可以用于治疗糖尿病、肾病、改善肾脏功能,治疗心、脑血管疾病等。本实验采用基因工程方法使人胰激肽原酶在大肠杆菌中得到高效表达,并研究其分离纯化工艺,得到重组人胰激肽原酶蛋白。由基因库查得人胰激肽原酶的基因序列,在序列前端添加肠激酶酶切位点,根据其氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计合成基因750bp。PCR扩增目的基因,将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b(+)中,重组质粒转入大肠杆菌Rosettatm (DE3)中。转化得到的重组大肠杆菌以IPTG诱导外源基因表达,经过SDS-PAGE电泳分析,在24KD处目标蛋白主要以包涵体形式存在。在37℃,pH为7.0时,以1.0mmol/L浓度的IPTG诱导6h,目的基因在大肠杆菌中的表达最佳,其在细胞总蛋白中含量可达52%。利用串联飞行时间质谱方式(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定蛋白,通过MASCOT2.1数据检索引擎比对序列,检出三个片段,得分108分,在可信范围内,确定了蛋白质一级结构的正确性。包涵体经洗涤、变性、复性、透析,得到重组人胰激肽原酶粗品含量为1035mg/L.将粗品人胰激肽原酶与人工合成底物Nα—苯甲酰—L—精氨酸乙酯(BAEE)作用,底物发生了明显的降解,进一步验证了重组表达的正确性。