甲氨蝶呤(MTX)是抑制二氢叶酸还原酶和胸苷酸合成酶的叶酸类似物,它可以阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸,并导致嘌呤、嘧啶和胸苷的合成受阻,从而影响DNA、RNA的合成,以及细胞生长。MTX常用于治疗淋巴细胞白血病、类风湿关节炎和成人银屑病,然而高剂量的MTX常引发口腔黏膜炎、肝功能和肾功能的损害、白细胞、血小板减少以及流产等毒副反应。高剂量的MTX可以使用亚叶酸钙进行急救,但是需要时刻监测MTX的浓度。因此,建立一种快速、简便、精确的方法来检测血液中MTX的浓度就显得尤为重要。本实验通过碳二亚胺法制备MTX免疫原(MTX-BSA和MTX-ACA-BSA)和MTX包被抗原(MTX-OVA)。通过紫外扫描图谱判断偶联效果,使用BCA蛋白定量法测得MTX-BSA、MTX-ACA-BSA 和 MTX-OVA 的蛋白浓度分别为 9.85、8.22 和 8.75 mg/mL,通过OPA法测定偶联比分别为36.34:1、21.59:1和10.18:1。使用MTX-BSA和MTX-ACA-BSA免疫小鼠,获得抗MTX鼠血清,鼠血清效价分别为1:40000和1:80000。以MTX-BSA免疫兔子获得效价为1:256000的抗MTX兔血清,选用亲和纯化法纯化兔血清,使用BCA蛋白定量法检测纯化抗体的蛋白含量为0.3 mg/mL。用棋盘法确定MTX-OVA和纯化抗体的最佳稀释度分别为0.125 μg/mL和2 μg/mL;采用抑制率确定1:3000的稀释度为酶标抗体的最佳稀释度,以此为基础确立MTX标准液选用1:10的人血清进行稀释,建立检测MTX的竞争抑制酶联免疫吸附实验。根据最佳的工作条件来组建MTX试剂盒,其检测范围是0.04 μM～2.00 μM,分析灵敏度是0.0188 μM,功能灵敏度是0.05 μM,具有良好的分析内精密度(小于10%)和分析间精密度(小于14%),其回收率在91%～105%之间。通过组建MTX试剂盒的加速实验,结果表明该试剂盒在4℃保存一年仍能继续使用。