腭裂是口腔也是全身较常见的先天性发育畸形，在亚洲、尤其是中国更是高发区。1996～2000年全国出生先天性畸形缺陷检测结果显示，先天性唇腭的发生率排在首位。对该畸形的治疗手段目前仅限于患者出生后的手术修补，术后仍然不能完全恢复患者语音功能，并影响以后牙齿萌出、排列和患者的心理健康。先天性腭裂属于多基因遗传性疾病，有许多基因协同作用参与疾病的发生。如能明确腭裂的发生机制，制定相应预防及早期诊断措施，将会有效预防腭裂畸形的发生。因此，有众多学者长期致力于腭裂畸形发生，机制的研究，试图揭示人类腭裂发生的秘密。本研究利用分子生物学的消减杂交技术，直接提取对照组和腭裂组小鼠发育形成期腭突组织中的mRNA，对两者之间差异表达的基因进行克隆和筛选，获得一系列与腭裂发生相关的基因，并初步探讨了相关基因的染色体定位、结构及作用。研究主要分为以下3部分内容 一．RA诱导的MSX-1基因在腭突间充质细胞中表达变化的研究 取妊娠12天CS7BL/6N系孕鼠的腭突组织，组织块培养法对腭突间充质细胞进行原代培养，免疫组化法进行波形丝蛋白、角蛋白、第八因子、NSE、S-100及HNK-1的单抗染色，进行细胞来源鉴定。培养5代后用于实验，分为实验组和空白对照组，实验组加入1×10^-8mol/L浓度的ATRA，原位杂交法检测MSX1基因在两组细胞中的表达变化。结果显示：对照组细胞处于增殖状态，MSX1基因表达弱阳性。而RA处理组的细胞出现增殖抑 第四军医大学博士学位论文制，细胞中 MS川基因表达呈较明显的阳性。原位杂交结果提示 MSX基因是RA发挥作用的靶基因，它的异常表达干扰了胯突细胞的正常增殖，二 小鼠胯裂相关基困的克隆及基因表达的意义 在建立的C57BL／6N近交系，J、鼠胯裂模型的基础上，提取妊娠12天69实验组和对照组胚鼠胯突的1llRNA，反转录合成CDNA，利用基于昨R的改良消J戍杂交技术首先建立小鼠聘裂差异表达CDNA文库。筛选文库，选取500hp。人上的片段回收，反向卢、杂交鉴定除去假阳性和假阴性克隆。利用Ge；旧a＊数据库对测得的基固序列进行核酸序列的同源性比较分析。结果：获得小鼠)J母乳形成中表达差异的4个新基因，经N0rtherl。blot 鉴定1号新基因为i亥基因 CDNA全长，定位于，J、鼠 9号染色体，共有碱基 850hp；编码 132个各基酸，经国际基因命名委员会批准将获得的新基因命名为MCPR．1（1ilo；Isecleftoalate related selle）。止匕夕；实验中还克隆三与细胞增殖、生长有关的核糖体基因士。L27、L23等和小鼠F。U基因。 核糖体蛋白在原核和真核细胞生物中广泛存在，近年来的研究发现它们与细胞凋亡有密切的关系，应用消减杂交技术克隆凋亡相关基因时，常常能克隆到核樵体基因。小鼠＊ 基因位于小鼠的第19号染色体长臂，具有管家基因的特征，广泛表达于胚胎发育期＊、鼠各内脏器官，但尚未见到在胯突未达的报道，它对细胞的生长具有抑制作用。本研究中核糖体、f。U基因的表达可能参与了聘突细胞的增殖周期相。制和凋亡过程。三．MCPR－1、rail基因在小鼠胯突及各脏器组织中的表达变化 原位杂交技术和阿一PCR检测了MCPR－］、厄U基因在实验组、对照组胚胎小鼠胯突组织，出生 1天和成年鼠各脏器中的表达情况。结果显示：MCPR＊1基因仅在实验组跨突组织中表达；与对照组小鼠相比 fan基因在实验组中的表达水平明显增高。叮一阿R结果显示：论叫一1基因在出生后小鼠胯突、。。)A、肝脏、脑等组织中均无表达；fan基因在出生1天及成年小鼠小鼠。。脏、肝脏、脑等组织中都有表达。本实验结果提示：MCPR－1基因是在＊诱导之下仅在胚胎跨突组织中表达的基困。而fail基因作为一种管家基因，在实验业小鼠胯突中的异常高表达，可能在聘突细胞增殖过程中起负向调控作用， 7 第四军医大学博士学位论文间接而参与了聘裂的发生。